Dissecção e Cultura do mouse e dopaminérgico do estriado explantes em três dimensões Ensaios matriz de colágeno
Summary
Explantes a partir do sistema de dopamina mesencéfalo e corpo estriado são utilizados num ensaio de matriz de colagénio para o<em> In vitro</em> Análise do desenvolvimento via mesostriatal e estriatal. Neste ensaio crescimento axonal e orientação podem ser manipulados e quantificado. Ele também pode ser modificado para avaliar outras regiões ou pistas moleculares.
Abstract
Mesencéfalo a dopamina (mdDA) projeto neurônios através do feixe medial do prosencéfalo para diversas áreas do telencéfalo, incluindo o 1 striatum. Reciprocamente, médio neurónios espinais no estriado que dão origem à via (directo) Estriatonigral inervam a substantia nigra 2. O desenvolvimento desses setores axônio é dependente das ações combinatória de uma infinidade de crescimento do axônio e pistas de orientação, incluindo as moléculas que são liberadas por neurites ou por regiões (Intermediário)-alvo 3,4. Estes factores solúveis podem ser estudada in vitro por mdDA cultura e / ou explantes do estriado em uma matriz de colagénio que proporciona um substrato tridimensional para os axónios que imitam o ambiente extracelular. Além disso, a matriz de colagénio permite a formação de gradientes relativamente estáveis de proteínas libertadas por explantes outros ou células colocadas na proximidade (por exemplo, ver as referências 5 e 6). Aqui descrevemos métodos para os finsificação de colágeno da cauda de rato, microdissecção de explantes e dopaminérgicos no estriado, a sua cultura em géis de colágeno e análise imuno-histoquímica e quantitativa posterior. Primeiro, o cérebro de embriões de camundongos E14.5 são isoladas e dopaminérgicos estriatais e explantes são microdissectados. Estes explantes são, em seguida, (co) cultivados em géis de colagénio em lamelas durante 48 a 72 horas in vitro. Posteriormente, as projeções axonais são visualizados por meio de marcadores neuronais (eg tirosina hidroxilase, DARPP32, ou tubulina βIII) e crescimento do axônio e respostas axônio atrativas ou repulsivas são quantificados. Esta preparação neuronal é uma ferramenta útil para estudos in vitro dos mecanismos celulares e moleculares do crescimento do axônio mesostriatal e estriatal e orientação durante o desenvolvimento. Utilizando este ensaio, também é possível avaliar outros (Intermediário) alvos para axônios dopaminérgicos e estriado ou para testar específicos pistas moleculares.
Protocol
Discussion
O ensaio de matriz de colagénio aqui descrita foi usada e melhorado por muitos laboratórios diferentes nas últimas décadas para investigar uma variedade de moléculas de direccionamento axonal e sistemas neuronais (por exemplo, ver as referências 5-8). Estes estudos demonstraram que este ensaio é uma ferramenta poderosa para estudar os efeitos de regulação e de moléculas de direccionamento axonal secretadas por diferentes tecidos (Intermediário) alvo.
No entanto, deve notar-se que …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O ensaio de matriz de colágeno foi desenvolvido e aperfeiçoado pelo trabalho de muitos diferentes grupos de pesquisa durante os últimos dois a três décadas. As abordagens descritas aqui para explantes e dopaminérgicos estriatais se beneficiar imensamente com esses estudos. Além disso, os autores gostariam de agradecer Asheeta Prasad por sua ajuda na criação de culturas de explante estriado. O trabalho no laboratório foi financiada pela Organização Human Programa de fronteira da Ciência (Prêmio de Desenvolvimento de Carreira), a Organização Neerlandesa de Pesquisa em Saúde e Desenvolvimento (ZonMW-VIDI e ZonMW-TOP), a União Europanian (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222999) (a RJP), e da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (TopTalent; para ERES).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA | M11-004 | |
| Hepes | VWR International | 441476L | |
| β-Mercaptoethanol | Merck | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 61100-087 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Gibco | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa-Cruz | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
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