Dissectie en Cultuur van de muis Dopaminerge en het striatum Explantaten in drie-dimensionale Collageen Matrix Assays
Summary
Explantaten de dopaminesysteem en striatum worden gebruikt in een collageenmatrix test voor het<em> In vitro</em> Analyse van mesostriatal en striatonigrale traject ontwikkeling. In deze test axonale uitgroei en begeleiding kan worden gemanipuleerd en gekwantificeerd. Het kan ook worden aangepast voor het beoordelen van andere regio's of moleculaire signalen.
Abstract
Dopaminesysteem (mdDA) neuronen project via de mediale voorhersenen bundel naar verschillende gebieden in de grote hersenen, waaronder het striatum 1. Omgekeerd, medium stekelige neuronen in het striatum die aanleiding geven tot de striatonigrale (directe) route innerveren de substantia nigra 2. De ontwikkeling van deze axon stukken is afhankelijk van de combinatorische acties van een overvloed aan axon groei en begeleiding signalen met inbegrip van moleculen die zijn vrijgegeven door neurieten of door (tussen) doel de regio's 3,4. Deze oplosbare factoren kunnen worden bestudeerd in vitro door het kweken mdDA en / of striatum explantaten een collageenmatrix met een driedimensionale substraat voor het nabootsen axons de extracellulaire omgeving zorgt. Bovendien is de collageenmatrix maakt de vorming van relatief stabiele gradiënten van eiwitten vrijgegeven door andere explantaten of cellen die in de nabijheid (zie bijvoorbeeld referenties 5 en 6). Hier beschrijven werkwijzen voor het purultieme controle van rattenstaart collageen, microdissectie van dopaminerge en het striatum explantaten, hun cultuur in collageen gels en de daarop volgende immunohistochemische en kwantitatieve analyse. Ten eerste, de hersenen van E14.5 muizenembryo's zijn geïsoleerd en dopaminerge en het striatum explantaten zijn gemicrodissecteerde. Deze explantaten worden vervolgens (co) gekweekt in collageengels op dekglaasjes 48 tot 72 uur in vitro. Vervolgens axonale projecties zijn gevisualiseerd met behulp van neuronale markers (bijvoorbeeld tyrosine hydroxylase, DARPP32 of βIII tubuline) en axongroei en aantrekkelijke of afstotende axon antwoorden worden gekwantificeerd. Deze neuronale voorbereiding is een handig hulpmiddel voor in vitro studies van de cellulaire en moleculaire mechanismen van mesostriatal en striatonigrale axongroei en begeleiding tijdens de ontwikkeling. Met deze assay, is het ook mogelijk om andere (tussen) doelen voor dopaminerge en striatum axonen beoordelen of specifieke moleculaire signalen testen.
Protocol
Discussion
De matrix van collageen-test hier beschreven is gebruikt en verbeterd door veel verschillende laboratoria in de afgelopen decennia aan een verscheidenheid van axon begeleiding moleculen en neuronale systemen te onderzoeken (zie bijvoorbeeld referenties 5-8). Deze studies hebben aangetoond dat deze test is een krachtig instrument voor het bestuderen van de effecten en de regulatie van axon begeleiding moleculen die afgescheiden wordt door verschillende (tussen) doel weefsels.
Er moet echter w…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De matrix van collageen test is ontwikkeld en verbeterd door het werk van vele verschillende onderzoeksgroepen de afgelopen twee tot drie decennia. De aanpak hier beschreven voor de dopaminerge en het striatum explantaten veel baat hebben bij deze studies. Daarnaast zou de auteurs willen Asheeta Prasad bedanken voor haar hulp bij het opzetten van striatale explant culturen. Werk in het lab werd gefinancierd door het Human Frontier Science Program Organization (Career Development Award), Nederland Organisatie van gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMw-VIDI-en ZonMW-TOP), de Europanian Unie (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222999) (in RJP), en Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (Toptalent, tot ERES).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Fetal Calf Serum | BioWhittaker | 14-801F | |
| Glutamine (200mM) | PAA | M11-004 | |
| Hepes | VWR International | 441476L | |
| β-Mercaptoethanol | Merck | 444203 | |
| Minimum Essential Media (MEM) | Gibco | 61100-087 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Gibco | 11415-049 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132660 | |
| Rabbit anti-Tyrosine Hydroxylase | Pel-Freez | P40101-0 | |
| Rabbit anti-Darpp32 (H-62) | Santa-Cruz | Sc-11365 | |
| Mouse anti-βIII tubulin | Sigma | T8660 | |
| Alexa Fluor labeled secondary antibodies | Invitrogen |
References
- van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. Getting connected in the dopamine system. Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).
- Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298, 1959-1964 (2002).
- Chilton, J. K. Molecules mechanisms of axon guidance. Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).
- Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
- Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system. Nature. 336, 775-778 (1988).
- Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting. J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).
- Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem. J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).
- Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum. J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).
- De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).
