Un sistema completamente automatizzato ed altamente versatile per test multi-funzioni cognitive e di registrare le attività neuronali in roditori

Panoramica del sistema Il sistema comprende tre componenti principali: (1) a doppia parete camera insonorizzata (Industrial Company Acoustical, Bronx, New York), (2) un multiplo sistema di registrazione dei canali elettrofisiologico (Neuralynx, Bozeman, MT) e (3) completamente automatizzato, sistema personalizzato di test comportamentali dalla Med Associates Inc. (St. Albans, VT). Come mostrato in figura 1A, la camera operante si trova all'interno della stanza insonorizzata. Un commutatore (modello SL-36, Dragonfly ricerca e sviluppo, Inc., Ridgeley, West Virginia) per il collegamento di cavi da headstage al sistema di registrazione elettrofisiologica (Figure1A-a), e una videocamera per il monitoraggio e la registrazione di comportamenti animali sono montati al di sopra la camera operante (Figure1A-b). Custom-designed Camera operante Il custom-designed, acusticamente trasparente Operant camera (Figure1A-d) consiste di tre pareti acusticamente trasparenti e un pannello modulare operativa (figura 1B). Tre altoparlanti Tweeter (Cage, ENV_224BM, Associates Med) montato sulla parte superiore del mezzo e due pannelli laterali sono utilizzati per emissione di segnali uditivi. Segnali uditivi sono generati da un calibrato, generatore audio programmabile (ANL-926). Una luce stimolo (ENV_221M) e due triple-stimolo display a LED (ENV_222M) si trovano sui pannelli centrali e laterali, rispettivamente. Queste luci di stimolo possono essere utilizzati per uditivo-visivi test comportamentali multi-sensoriali. Un dispositivo Poke naso con tre luci di colore LED (ENV_114M) è montato nella parte inferiore del pannello centrale. Un rivelatore a infrarossi installata all'interno dell'unità Poke naso è usato per segnalare frugando il naso e periodo di detenzione. Le luci a LED all'interno dell'unità Poke naso può essere utilizzato per la formazione naso-hold all'interno del foro. Una risposta leva mobile (ENV_112CM) è montato su ciascun lato del pannello operante. La mobility di queste leve consente un controllo flessibile della presenza delle leve, che può essere efficacemente utilizzato sia per la formazione iniziale compito e lo studio di importanti funzioni cognitive del cervello (vedi sotto). Quattro coppie di sorgenti di raggi infrarossi e sensori (EVN_253SD) controllati da un canale quattro IR controllore (ENV_253) sono posizionati sul fondo della camera sia per indicare le posizioni dell'animale e controllare altri dispositivi basata sulla posizione di un animale (Figura 1A- e). Due dosatori pellet ciascuno con incorporato un sentinella infrarossi (ENV_203M-45IR) vengono utilizzati per l'erogazione di premi in recipienti pellet (Figura 1A-c). La sentinella infrarossi viene utilizzato per il monitoraggio fallimento del distributore di pellet e di fornire segnali di avvertimento. Configurazione del sistema La panoramica di connessioni e componenti hardware è illustrata in figura 2. Funzionalmente, ci sono due parallele, interattivosottosistemi: uno per la formazione comportamento e l'altra per la registrazione elettrofisiologica. Le due sotto-sistemi sono sincronizzati attraverso l'MED-PC piattaforma IV Software (SOF-735). Il computer invia comandi ai dispositivi comportamentali e legumi TTL al sistema di registrazione neurale (segnale flussi indicati dalle frecce rosse in figura 2), e riceve segnali generati da reazioni dell'animale e attività neurali (segnale flussi indicati dalle frecce verdi e blu, rispettivamente, in figura 2). Questi sistemi paralleli, interattivi permettono registrazioni di sincronizzati comportamentali / neuronale dati e consentire la manipolazione del comportamento animale sulla base di attività neuronale, o viceversa. Comportamento formazione sub-sistema Un pannello di connessione SmartCtrl (SG-716B) serve come bidirezionale pannello di comunicazione: ovvero l'invio dei segnali di controllo (freccia rossa in figura 2) dal computer ai dispositivi comportamentali (elencato nella scatola rossa), e transmit dell'animale segnali di risposta (freccia verde in figura 2) al computer. Le uscite del canale quattro IR controllore (ENV_253) vengono instradati nel pannello connessione. Una scheda di interfaccia (interfaccia SmartCtrl carta, DIG-716B) e una scheda di decodifica (DIG-700F) comunica i segnali dal pannello di connessione ad una scheda PCI (DIG-704PCI) installato nel computer. I segnali uditivi sono generati dal generatore dello stimolo (ANL-926), anch'esso controllato dal MED-PC Software IV attraverso la scheda di decodifica (DIG-700F). Come illustrato nella figura 2, tutte le schede di interfaccia sono ospitati in un cabinet di interfaccia da tavolo (SG-6080D). Questo mobile fornisce anche i poteri per tutti i dispositivi di comportamento. Segnali di risposta elettrofisiologici registrazione sub-sistema Animals 'ricevuti dal computer vengono istantaneamente inviati al sistema di registrazione neurale attraverso il TTL SuperPort scheda (DIG-726) e il Cheetah Digital scatola dell'interfaccia (Neuralynx, Bozeman, MT) (Figura 2). Questi eventi sono comportamenti tempo timbrato e registrato simultaneamente con le attività neurali. Neurali picchi rilevati in linea dal sistema di registrazione Neuralynx possono essere usati come segnali di ingresso al controllo comportamentale sub-sistema per manipolare o interferire comportamento animale. Viceversa, segnali di risposta dell'animale possono essere utilizzati come inneschi per manipolare o attività interferenti neuronali quando combinato con tecniche di stimolazione elettrica o optogenetic. Questi approcci sarà prezioso per la comprensione della causalità tra attività neuronali e comportamenti. Programmazione e trattamento dei dati I programmi di controllo del comportamento sono scritti con Trans IV software (Thomas A. Tatham e MED Associates) e compilato con il compilatore Pascal. Automazione di ogni fase di formazione viene realizzata caricando il programma Trans IV nella MED-PC Software IV. Parametri di allenamento possono essere regolati anche on-line da formatori wsebbene il MED-PC IV software è in esecuzione. I codici IV Trans bisogno di essere specifico sia per configurazione del sistema e compito comportamentale. Programmi di formazione standard sono, tuttavia, liberamente disponibile presso il Associates MED e può essere modificato per soddisfare le esigenze specifiche di laboratorio individuale. I programmi di formazione utilizzati nelle nostre installazioni sono inoltre disponibili gratuitamente su richiesta. Dati comportamentali vengono salvati automaticamente dal MED-PC Software IV. I dati salvati possono essere tradotti in file di Microsoft Excel utilizzando l'MED-PC Per programma Excel (MPC2XL, Thomas A. Tatham and Associates MED). I file di Excel translated può essere importato e analizzati in un ambiente MATLAB (The MathWorks, Natick, MA). I dati neurali insieme con i timestamp di eventi comportamentali registrati con il software Cheetah (Cheetah 5, Neuralynx, Bozeman, MT) possono anche essere importati in MATLAB per l'analisi. Formazione Per illustrare il funzionamento di questo sistema, descriviamo quiTwo-Alternative Scelta discriminazione Task Pitch, progettato per esaminare la soglia di discriminazione frequenza di un topo. Una illustrazione schematica del compito viene mostrato nella Figura 3. 1. Pre-training Inizia con maschio adulto ingenuo, Sprague-Dawley, ratti, età ~ 60 giorni. Prima dell'allenamento, limitare l'assunzione di cibo fino a quando il peso dell'animale è ~ 90% del peso ad libidum basale. 2. Cage Acclimatazione Per preparare la camera per acclimatazione, ritirare le leve e bloccare il foro Poke naso con un tappo di gomma (fatta dallo stantuffo di una siringa da 60 cc) per evitare che animali di attivare il naso-poke dispositivo. Luogo ~ 20 palline completamente nutrizionali (45 mg, Product # F0021, BioServ, Frenchtown, NJ) in ogni recipiente pellet (cibo tazza). Mettere un animale ingenuo nella camera di acclimatazione. Il ratto inizierà presto ad esplorare le coppe alimentari e mangiare i pellets. <li> Quando entrambe le coppe alimentari sono vuoti, utilizzare il software di controllo per erogare un singolo pellet in ogni vassoio. In tal modo, il ratto imparerà ad associare il cibo con la coppa. Forzare l'ratto a muoversi su entrambi i lati della camera di erogazione pellets casualmente in ogni tazza cibo. Una sessione di 30 minuti di solito è sufficiente per stabilire il cibo-cup associazione. In una sessione di 30 minuti, il ratto ottiene solitamente 200 – 300 pellet, che sono sufficienti a mantenere il loro peso corporeo in un livello costante di ~ 90% del valore basale. 3. Leva-push Formazione In una nuova sessione, estendere entrambe le leve nella camera e lasciare il bicchiere vuoto alimentare. Quindi, posizionare un ratto acclimatato nella camera. Quando l'animale entra prossimità di una leva, erogare un pellet manualmente attraverso il software PC Med-IV. Fornire inoltre ricompense quando il ratto mostra interesse per la leva, come annusare, toccare, o arrampicata. Una leva di spinta accidentale dovrebbe innescare una ricompensa automaticam ente attraverso il programma. Per incoraggiare la leva di spinta e di forzare l'esplorazione di due leve, che l'animale possa spingere ciascuna leva consecutivamente un numero limitato di volte. Quando il limite viene raggiunto, ritirare la leva. Quando entrambe le leve sono ritirati, li estendono a ripetere la procedura. Gradualmente diminuire il limite fino ritrae leva ogni volta che viene spinto esso. Da uno a due sessioni di 30 minuti sono di solito sufficienti per stabilire la leva di spinta – ricompensa associazione del settore alimentare. 4. Nose-poke Formazione In una nuova sessione, ritirare le leve, e rimuovere il tappo di gomma dal Poke naso. Posizionare pellets diversi all'interno del Poke naso per incoraggiare l'interesse ratto a esplorare il naso-poke dispositivo. Reintrodurre il animale nella camera. Estendere una delle due leve a caso quando il ratto annusa il naso-poke foro per pellets alimentari. Vedendo la leva estesa, il topo si avvicina e spingere la leva per ottenere un alimento pellet. Dopo la leva viene premuto e il premio viene erogato, ritirare la leva per incoraggiare il ratto di esplorare il dispositivo Poke naso. Di solito ci vogliono circa 20 a 30 minuti per imparare la sequenza di attività: Nose-poke → estensione Leva → leva di spinta → Rewards. 5. Cue Training In una nuova sessione, riprodurre i segnali uditivi in ​​seguito a un naso-poke evento con un breve ritardo (da 100 a 250 ms). Estendere le due leve di sinistra e destra tra breve (100 ms) dopo ogni presentazione cue uditivo. Ricompensate il ratto solo quando spinge la leva che è indicata dalla stecca uditivo. L'animale imparerà gradualmente ad associare uno specifico cue uditivo con una leva. L'animale è quindi libero di iniziare un nuovo processo con la sequenza: Nose-poke Cue → → → Premio leva di spinta / No Reward (Figura 3). A causa di alto tasso di falsi nelle sessioni di formazione iniziale, complementare food deve essere somministrato a mantenere il peso corporeo dopo ogni sessione di allenamento. Nei prossimi varie sessioni di 30 minuti, lasciare che il ratto pratica l'attività appena imparato fino ad un livello di prestazioni costante è raggiunto (vedi figura 3A per una curva di apprendimento tipico). Una volta che il compito è padroneggiata, un topo può ottenere circa 200 – 300 pellets in ogni sessione di 30 minuti, che sono sufficienti a mantenere il suo peso corporeo. 6. Risultati rappresentativi In seguito il protocollo sopra, ratti addestrati a riconoscere due diversi modelli di impulsi tono puro treni costituito da sei semi tono o con la stessa frequenza (F, F, F, F, F, F) o frequenze differenti (F, F-Af , F, F-Af, F, F-Af) 1-5. Ogni pip tono è 200 ms nella durata e l'intervallo di pip tono è di 400 ms. Nel presente studio, F era regolato per essere 10 kHz e Af variava da 1 a 50% del F (figura 3, parte superiore). In genere, Af è stato fissatoal valore relativamente elevato durante le sessioni di allenamento: 5 kHz, 4 kHz, 3 kHz, 2 kHz e 1 kHz, per facilitare la formazione. Ogni treno di impulsi tono puro con un valore diverso Af è stato presentato in modo casuale in una determinata sessione. Il Two-alternativa Pitch Task Choice discriminazione è illustrato in Figura 3. I ratti sono stati addestrati a ficcare il naso nel foro naso (Figura 1B e Figura 3, in basso) per avviare un processo. Poke naso innesca la trasmissione dei segnali uditivi. All'atto della rilevazione dei segnali, i ratti hanno bisogno di correre al lato corretto della camera, avvicinarsi alla leva, attendere che la leva per estendere nella camera, e poi spingere la leva all'interno di una finestra di tempo determinato (tempo attiva la leva da 1 a 2 secondi) per ottenere un premio (Figura 3). Il tasso di successo è stato calcolato per ciascun valore Af come il numero di prove colpite diviso per il numero di prove totali per ogni singolo valore di Af. Un criterio del 75%tasso di successo è stato utilizzato per indicare che il topo aveva imparato il compito. Una curva di apprendimento tipica di un ratto è presentato in Figura 4A. Ogni linea colorata rappresenta il processo di apprendimento per ogni treno di impulsi con Af diverso (ΔF0 rappresenta il treno di impulsi costanti). In media, ci sono voluti circa sette sedute di allenamento (a partire dalla prima sessione di presentazione uditiva cue, Fase 5 Cue Training) per raggiungere il 75% criterio del tasso di hit. Questo sistema permette inoltre caratterizzazione quantitativa del comportamento animale nell'esecuzione del compito progettato da sperimentatori. Tre misurazioni che sono ampiamente usati in studi comportamentali animali sono mostrati nella Figura 4 B – D Il tempo di reazione, riflettendo principalmente l'attenzione di un animale al compito, è stata misurata come passaggio di tempo tra l'inizio della stecca uditivo e leva di spinta.. L'inter-trial intervallo, che ha evidenziato commesso un animale era al compito in cui l'animale ha avviato ogni provae non è stato punito con time-out nella prova falsa, è stata tracciata nella Figura 4C. La variazione temporale della prestazione all'interno di una sessione, che rappresenta i modelli dinamici di prestazioni complessive di un animale e che riflette il miglioramento / adattamento che potrebbe verificarsi all'interno di una singola sessione, è stata tracciata nella Figura 4D. Ogni sessione è stata divisa in fase iniziale, intermedio e in ritardo (10 minuti per ogni fase). Numero di premi accumulati in ogni fase sono stati utilizzati in questa misura. La base neurale di diversi comportamenti cognitivi (Figura 5A e vedi discussione) possono essere affrontati con questo sistema registrando le attività neurali degli animali che svolgono un compito. Esempi di attività neurale registrati simultaneamente nel nucleo basale (NB) e la zona ventrale tegmentale (VTA) di un cervello di ratto sono mostrati in figura 5B e C. I licenziamenti dei neuroni sono tempo timbrato mettere in relazione ad ogni evento del processo (ad esempio come nose-poke,leva di spinta, cue presentazione uditiva e riconoscimento, e la effettiva ricezione della ricompensa) e analizzati in relazione a tali eventi relativi alle attività comportamentali. I risultati combinati di registrazione dell'attività comportamentale e neurale con questo sistema sarà fruttuosa nel chiarire le basi neurali di una varietà di comportamenti cognitivi. Figura 1. I componenti principali del sistema (A) e un disegno schematico della misura camera uditivo operante (B). A. La camera operante si trova in una doppia parete insonorizzata camera. Cunei di schiuma anecoiche sono montati in tutte le pareti della stanza per eliminare dispersione del suono e la deformazione a:. Collettore per il routing dei cavi per il sistema di registrazione dell'attività neuronale, b: Telecamera per monitorare e registrare il comportamento animale; c: Pellet distributori; d: camera operante . e:Ricevitori a infrarossi. B. La camera operante è composto da tre pareti acusticamente trasparenti e uno modulare il funzionamento del pannello. Vedere il testo per le descrizioni dettagliate. Figura 2. Schema del sistema. Il sistema è composto da due sotto-sistemi: formazione comportamentale e sistema di registrazione dell'attività neuronale. I due sottosistemi in modo interattivo comunicano tra loro attraverso impulsi TTL (vedere Configurazione del sistema per maggiori dettagli). Le frecce rosse rappresentano i comandi e / o eventi comportamentali inviati dal computer, le frecce verdi indicano segnali di risposta animali alimentazione al computer, e la freccia blu rappresenta ingressi di eventi neurali picchi rilevati on-line con il sistema di registrazione Neuralynx. Figura 3. Due alternative ChTask Frequenza OICE discriminazione. Top, diagramma a blocchi che mostra la sequenza di attività di base. Bottom, Rappresentazione schematica delle principali azioni comportamentali. Le frecce verdi indicano il flusso sequenziale del compito. Figura 4 risultati rappresentativi di due alternative Task discriminazione Frequenza Scelta A. curve di apprendimento:.. Ogni linea colorata rappresenta il processo di apprendimento di un ratto su una discriminazione di ogni variazione di frequenza (ΔFs). La linea scura rappresenta la curva di apprendimento mediato per le variazioni di frequenza. B. Distribuzione dei tempi di reazione misurata come giri di tempo da l'insorgenza di spunto alla spinta della leva. C. Distribuzione di inter-trial intervallo. D. dinamiche temporali di prestazioni all'interno di una sessione misurata con premi accumulati ottenuti in fase iniziale, media e tardiva di una sessione. All i dati in B – D è stato ottenuto nella fase finale quando le prestazioni del topo era il tasso di successo del 75%. Figura 5. Esempio di comportamenti cognitivi e funzioni cerebrali che possono essere studiati utilizzando il sistema. A. comportamenti cognitivi. Le didascalie top descrivono ogni azione in una sequenza di uno studio. Le didascalie inferiori indicano i comportamenti cognitivi che possono essere studiate. Si noti che entrambe le leve sono stati estratti in tutte le immagini tranne d in cui la leva è nella lavorazione di estendere nella camera. B. cottura schemi di un neurone registrato nel NB di un topo eseguire due scelta compito uditivo. Alto, Raster trama immagine di sparare su ogni prova. Ogni rettangolo colorato rappresenta il lancio della cellula e la frequenza di scarica è codificata dal colore. Bottom, Peri, ancheistogramma t del tasso di cottura. Nota la costituzione della cottura prima dell'azione (spingendo la leva al tempo zero microsecondi, indicato dalla linea tratteggiata rossa verticale) e dispersione graduale della cottura dopo l'azione. C. cottura schemi di un neurone registrati nel VTA di un topo di eseguire la due-scelta compito uditivo. Top, immagine Raster trama del lancio di un singolo neurone VTA su ogni prova. Ogni rettangolo colorato rappresenta il lancio del neurone VTA e la sua velocità di fuoco è codificata dal colore. Bottom, Peri-evento istogramma della frequenza di scarica mostrato nell'immagine raster. Nota la cottura sparse immediatamente prima che l'azione di leva spinta (al tempo zero microsecondi, indicato dalla verticale rosso-linea tratteggiata) e cottura vigorosa durante il periodo di tempo quando il topo è ottenere il premio. L'attività di questo neurone è praticamente in silenzio tra queste due azioni. Stereotrodes tungsteno impiantati nel cervello sono stati utilizzati per record attività neurali contemporaneamente dalla NB e VTA, mentre il topo stava eseguendo l'operazione. Spike-selezione è stata effettuata off-line utilizzando SpikeSort 3D Software (Neuralynx, Bozeman, MT).