Preparação de amostras de<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Extractos para Estudos Nucleares metabolômica Ressonância Magnética
Summary
O perfil de metabolômica<em> Mycobacterium tuberculosis</em> É determinada após crescimento em culturas em caldo. As condições podem ser variadas para testar os efeitos de suplementos nutricionais, oxidantes e agentes anti-tuberculose no perfil metabólico deste microrganismo. Procedimento para a preparação de extracto é aplicável tanto para 1D<sup> 1</sup> H e 2D<sup> 1</sup> H-<sup> 13</sup> Análises de C NMR.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis é uma das principais causas de mortalidade em seres humanos em escala global. O surgimento de ambos multi-(MDR) e-(XDR) resistentes à drogas-cepas ameaça descarrilar os esforços atuais de controle da doença. Assim, há uma necessidade urgente de desenvolver drogas e vacinas que são mais eficazes do que aqueles atualmente disponíveis. O genoma de M. tuberculose tem sido conhecida há mais de 10 anos, ainda existem lacunas importantes no conhecimento da função dos genes e essencialidade. Muitos estudos têm utilizado uma vez que a análise da expressão do gene, tanto a nível transcriptomic e proteômica para determinar os efeitos das drogas, oxidantes, e condições de crescimento sobre os padrões globais de expressão do gene. Em última análise, a resposta final destas alterações é reflectido na composição metabólica da bactéria incluindo alguns milhares de pequenos produtos químicos de peso molecular. Comparando os perfis metabólicos de tipo selvagem e estirpes mutantes, quer não tratadas ou treated com um fármaco particular, podem efectivamente permitir a identificação do alvo e pode levar ao desenvolvimento de novos inibidores com actividade anti-tuberculoso. Da mesma forma, os efeitos de duas ou mais condições do metaboloma pode também ser avaliada. Ressonância magnética nuclear (RMN) é uma tecnologia poderosa, que é utilizado para identificar e quantificar os intermediários metabólicos. Neste protocolo, os processos para a preparação de M. extractos de células de tuberculose para análise de RMN são descritos metabolômica. As culturas de células são cultivadas em condições adequadas e exigidas Biossegurança Nível 3 de confinamento, uma colhidas e submetidas a lise mecânica, mantendo a temperaturas frias para maximizar a preservação de metabolitos. Os lisados de células são recuperadas, filtrado esterilizado e armazenado a temperaturas ultra-baixas. Alíquotas destas extractos celulares foram semeadas em agar Middlebrook 7H9 para unidades formadoras de colónias para verificar a ausência de células viáveis. Após dois meses de incubação a 37 ° C, na ausência de vicolónias capazes são observadas, as amostras são removidas da unidade de contenção para o processamento a jusante. Os extratos são liofilizadas, ressuspensas em tampão de deuterado e injectada no instrumento de RMN, a captura de dados espectroscópicos que é então submetida a análise estatística. Os procedimentos descritos podem ser aplicados tanto para unidimensional (1D) 1 H NMR e de duas dimensões (2D) 1 H-13 C análises de RMN. Esta metodologia proporciona mais fiável de identificação de baixo peso molecular e do metabolito mais fiáveis e sensíveis análises quantitativas de composições de extracto de células metabólicas de métodos cromatográficos. Variações do processo descrito a seguir ao passo de lise de células pode também ser adaptado para análise proteômica paralelo.
Protocol
Discussion
Um número significativo de estudos analisaram os perfis transcriptomic e proteômica de M. tuberculosis, sob uma variedade de ensaios in vitro e in vivo. 11-16 Em última análise, as alterações na expressão de genes e a actividade da enzima levar a variações nas concentrações de pequenas moléculas de peso molecular. A descrição completa destes compostos constitui o metaboloma. Assim, os efeitos da droga e as condições de crescimento diferentes sobre as vias me…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a todos os membros dos laboratórios do Dr. Barletta e Poderes Dr. pelos comentários úteis durante o desenvolvimento do protocolo. Agradecemos Wendy Austin para discussões úteis e revisão do manuscrito. O trabalho descrito neste manuscrito foi financiado por doações piloto de sementes para cada investigador listados acima, da Universidade de Nebraska-Lincoln Center Biologia Redox (pai concessão # NCRR 2P20RR 017675, D. Becker, PI). Além disso, podemos agradecer ao Dr. Ofelia Chacon do fornecimento de fundos a partir de sua concessão R21 (1R21AI087561-01A1) para fontes de pesquisa e de apoio Sr. Halouska do salário parcial de padronizar as técnicas de RMN incluídos nesta publicação.
Materials
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| ADC Enrichment | BD BBL Middlebrook | 212352 | |
| BACS-120 Sample Changer | Bruker | ||
| Bruker Avance NMR | Bruker | 500 MHz | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | Fraction V |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-15R | Benchtop |
| Centrifuge Tubes | Corning | 430291 | 50 ml sterile polypropylene |
| Cryogenic Vials | Corning | 430488 | 2.0 ml sterile polypropylene |
| Cycloheximide | A.G. Scientific | C-1189 | Toxic |
| D(+) – Glucose | ACROS | 41095-0010 | |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 617385 | |
| Erlenmeyer Flask | VWR | 89095-266 | Sterile, flat base, polycarbonate, 0.22 μm PTFE membrane vented cap |
| Flash Freeze Flask | VWR | 82018-226 | 750 ml |
| Freeze Dryer | VWR | 82019-038 | 4.5 L Benchtop |
| Glycerol | GibcoBRL | 15514-029 | |
| Incubator | New Brunswick | Innova 40 | Benchtop shaker |
| Lysing Matrix B | MP Biomedicals | 6911-100 | |
| Lysis Machine | MP Biomedicals | FastPrep-24 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | Benchtop |
| Microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | Benchtop |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco | 271310 | |
| NMR tubes | Norell | ST500-7 | 5mM |
| OADC Enrichment | BD BBL Middlebrook | 212351 | |
| Oleic Acid | Sigma | O1008 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | VWR | BDH0266 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | VWR | BDH0268 | |
| Rotor – Microfuge 22R | Beckman Coulter | F241.5P | Sealed and polypropylene |
| Rotor – Allegra X-15R | Beckman Coulter | SX4750 | With bio-certified covers |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium-3-trimethylsilylpropionate-2,2,3,3-D4 | Cambridge Isotope | DLM-48 | |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU-530 | |
| Spectrophotometer Cuvettes | LifeLINE | LS-2410 | 1.5 ml polystyrene, 2 clear sides |
| Syringe | Becton Dickinson | 309585 | Sterile, 3 ml Luer-Lok |
| Syringe Filter | Nalgene | 190-2520 | 0.2 μm sterile cellulose acetate |
| Tween 80 | Fisher Scientific | BP338-500 |
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