Preparazione del campione di<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Estratti di studi di risonanza magnetica nucleare metabolomica

Mycobacterium tuberculosis è una delle principali cause di mortalità degli esseri umani su scala globale. L'emergere di due multi-(MDR) e estesamente-(XDR) ceppi farmaco-resistenti minaccia di far deragliare attuali sforzi di lotta contro la malattia. Pertanto, vi è una necessità urgente di sviluppare farmaci e vaccini che sono più efficaci di quelle attualmente disponibili. Il genoma di M. la tubercolosi è nota da più di 10 anni, ma ci sono importanti lacune nella nostra conoscenza della funzione genica e essenzialità. Molti studi hanno utilizzato da analisi di espressione genica sia a livello trascrittomica e proteomica per determinare gli effetti dei farmaci, ossidanti, e le condizioni di crescita sui modelli globali di espressione genica. In definitiva, la risposta finale di questi cambiamenti si riflette nella composizione metabolico del batterio comprendere alcune migliaia di sostanze a basso peso molecolare. Confrontando i profili metabolici di tipo selvatico e mutanti, sia trattata o treated con un particolare farmaco, può effettivamente permettere l'identificazione di destinazione e può portare allo sviluppo di nuovi inibitori con attività anti-tubercolare. Analogamente, gli effetti di due o più condizioni del metaboloma può anche essere valutato. Risonanza magnetica nucleare (NMR) è una tecnologia potente che viene utilizzato per identificare e quantificare intermedi metabolici. In questo protocollo, le procedure per la preparazione di M. tubercolosi estratti cellulari per l'analisi NMR metabolomica sono descritti. Colture di cellule vengono coltivate in condizioni appropriate e richiesto livello di biosicurezza 3 di contenimento ^1, raccolte e sottoposte a lisi meccanica pur mantenendo basse temperature per massimizzare la conservazione dei metaboliti. Lisati cellulari sono recuperati, filtrati sterilizzato, e conservati a temperature bassissime. Aliquote di questi estratti di cellule sono piastrate su agar Middlebrook 7H9 per unità formanti colonia per verificare l'assenza di cellule vitali. Su due mesi di incubazione a 37 ° C, se non vicolonie capaci si osservano, i campioni vengono rimossi dalla struttura di contenimento per il trattamento a valle. Sono estratti liofilizzati, risospese in tampone deuterato e iniettato nello strumento NMR, catturando dati spettroscopici che viene poi sottoposto ad analisi statistica. Le procedure descritte possono essere applicate sia unidimensionale (1D) ¹ H NMR e bidimensionale (2D) ^{1 H-13} C NMR. Questa metodologia fornisce più affidabile di identificazione piccolo peso molecolare metabolita e analisi quantitative più affidabili e sensibili di composizioni estratto cellulare metaboliche rispetto ai metodi cromatografici. Variazioni della procedura descritta in seguito alla fase di lisi cellulare può anche essere adattato per parallela analisi proteomica.