הערכת שינויים מטבוליים כבדית במהלך להתיישבות מתקדמת של עכבר נבט בחינם על ידי 1 H NMR ספקטרוסקופיה
Summary
הליך קולוניזציה פרוגרסיבי מתואר להמשיך להעריך את השפעתה על מטבוליזם בכבד המארח. ההתיישבות מנוטר הלא פולשני על ידי הערכת הפרשת השתן של חיידקים שיתוף מטבוליטים על ידי אפיון NMR מבוססי המטבולית בזמן חילוף החומרים בכבד נבחנת על ידי Magic רזולוציה גבוהה זווית ספינינג (MAS HR) פרופיל התמ"ג של ביופסיה ללא פגע.
Abstract
זה ידוע היטב כי חיידקי מעיים לתרום באופן משמעותי הומאוסטזיס המארח, מתן מגוון של הטבות כגון ההגנה החיסונית וסינתזה ויטמין. הם גם מספקים את המארחת עם כמות רבה של חומרים מזינים, מה שהופך את המערכת האקולוגית איבר מטבוליים חיוניים. בהקשר של ראיות הגוברת של הקשר בין צמחיית המעיים ואת תסמונת מטבולית, הבנת האינטראקציה בין מטבולית המארח החיידקים במעיים שלו הופכת לאתגר החשוב של הביולוגיה המודרנית. 1-4
להתיישבות (המכונה גם תהליך נורמליזציה) מייעדת את הקמתה של מיקרו אורגניזמים חיה נבט ללא לשעבר. אמנם תהליך טבעי המתרחש בלידה, הוא משמש גם נבט ללא בעלי חיים בוגרים כדי לשלוט על המערכת האקולוגית פרחים במעיים ובהמשך לקבוע את השפעתה על מטבוליזם המארח. הליך נפוץ לשלוט בתהליך הקולוניזציה היא להשתמש בשיטה gavage עם singlדואר או תערובת של מיקרו אורגניזמים. התוצאה היא שיטה קולוניזציה מהירה מאוד ומציג את החיסרון של להיות מלחיץ מאוד 5. לכן כדאי לצמצם את הלחץ כדי להשיג תהליך הקולוניזציה איטי לצפות בהדרגה את ההשפעה של הקמת חיידקי על המטבוליזם המארח.
בכתב היד הזה, אנו מתארים הליך להעריך את השינוי של חילוף החומרים בכבד במהלך תהליך הקולוניזציה הדרגתי באמצעות שאינו הרסני פרופיל טכניקה מטבולית. אנו מציעים לעקוב קולוניזציה של חיידקים במעי על ידי בחינה של פעילות מטבולית של חיידקים במעיים לידי ביטוי בהפרשת השתן של חיידקים שיתוף מטבוליטים על ידי פרופיל מטבולי 1 H NMR מבוססות. זה מאפשר הערכה של היציבות של פעילות חיידקים במעיים מעבר להקמת יציב של המערכת האקולוגית של חיידקים במעיים העריכו בדרך כלל על ידי חיידקים בצואה על ידי ניטור DGGE (denaturing ג'ל אלקטרופורזה שיפוע). 6קולוניזציה מתרחשת בסביבה פתוחה קונבנציונאלי הוא שיזם החול מלוכלך מלוכלך על ידי בעלי חיים רגילים, אשר תשמש שולטת. מכרסמים להיות חיות coprophagous, זה מבטיח קולוניזציה הומוגנית כפי שתואר לעיל. 7
פרופיל מטבולי כבדית נמדדת ישירות באמצעות ביופסיה בכבד שלם 1 H ברזולוציה גבוהה קסם זווית ספינינג NMR ספקטרוסקופיה. טכניקה זו וכמותיות מציע דרך מהירה להעריך, מבלי לפגוע במבנה התא, מטבוליטים גדולות כמו טריגליצרידים, גלוקוז גליקוגן כדי לקדם להעריך את יחסי הגומלין המורכבים בין תהליך הקולוניזציה ואת חילוף החומרים בכבד 7-10. שיטה זו יכולה לחול גם על כל רקמה ביופסיה 11,12.
Protocol
Discussion
בפרוטוקול זה, תיארנו תהליך הקולוניזציה פרוגרסיבי בסביבה פתוחה להמשיך לחקור את ההשפעה של החיידקים במעיים על מטבוליזם בכבד על ידי העריכו 1 פרופיל H MAS NMR HR של ביופסיה ללא פגע. שיטות שונות של קולוניזציה תוארו בספרות. השיטות הנפוצות ביותר ליישב חיות עם החיידקים מוגד?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
כל ספקטרום NMR לשמש דוגמאות להמחשה נגזרות במחקר שפורסם בעבר 7 אשר נתמך כלכלית על ידי נסטלה.
Materials
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 2.5 mm microtube | New Era | NE-H5/2.5-V-Br | |
| 1.7 mm capillary tube | Sigma-Aldrich | NORS175001 | |
| Capillary adapter | New Era | NE-325-5/1.7 | |
| Extraction rod | New Era | NE-341-5 | |
| HR-MAS rotor BL4 with 50 μL spherical Teflon spacer kit |
Bruker | HZ07213 | |
| Tool kit for 50 μL inserts | Bruker | B2950 | |
| Advance III 600 MHz NMR | Bruker | ||
| 1H HR MAS NMR solid probe | Bruker | ||
| Deuterium oxide 99.9 % | Sigma-Aldrich | 530867-1L | |
| 3-(trimethylsilyl)propionic acid-d4 (TSP) |
Sigma-Aldrich | 269913 |
References
- Cani, P. D., Delzenne, N. M. Gut microflora as a target for energy and metabolic. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 10, 729-734 (2007).
- Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444, 1022-1023 (2006).
- Raoult, D. Obesity pandemics and the modification of digestive bacterial flora. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 27, 631-634 (2008).
- Turnbaugh, P. J., Backhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-induced obesity is linked to marked but reversible alterations in the mouse distal gut microbiome. Cell. Host. Microbe. 3, 213-223 (2008).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 43, 42-51 (2004).
- Muyzer, G., Smalla, K. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Antonie van Leeuwenhoek. 73, 127-141 (1998).
- Claus, S. P. Colonization-induced host-gut microbial metabolic interaction. MBio. 2, (2011).
- Waters, N. J. High-resolution magic angle spinning 1H NMR spectroscopy of intact liver and kidney: optimization of sample preparation procedures and biochemical stability of tissue during spectral acquisition. Anal. Biochem. 282, 16-23 (2000).
- Bollard, M. E. High-resolution 1H and 1H-13C magic angle spinning NMR spectroscopy of rat liver. Magnetic resonance in medicine. 44, 201-207 (2000).
- Lindon, J. C., Holmes, E., Nicholson, J. Pattern recognition methods and applications in biomedical magnetic resonance. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 39, 1-40 (2001).
- Tate, A. R. Distinction between normal and renal cell carcinoma kidney cortical biopsy samples using pattern recognition of (1)H magic angle spinning (MAS) NMR spectra. NMR. Biomed. 13, 64-71 (2000).
- Wang, Y. Topographical variation in metabolic signatures of human gastrointestinal biopsies revealed by high-resolution magic-angle spinning 1H NMR spectroscopy. Journal of Proteome Research. 6, 3944-3951 (2007).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times. The review of scientific instruments. 29, 688-691 (1958).
- Nicholson, J. K., Holmes, E., Wilson, I. D. Gut microorganisms, mammalian metabolism and personalized health care. Nat. Rev. Microbiol. 3, 431-438 (2005).
- Martin, F. P. Effects of probiotic Lactobacillus paracasei treatment on the host gut tissue metabolic profiles probed via magic-angle-spinning NMR spectroscopy. Journal of Proteome Research. 6, 1471-1481 (2007).
- Swann, J. R. Variation in Antibiotic-Induced Microbial Recolonization Impacts on the Host Metabolic Phenotypes of Rats. J. Proteome. Res. , (2011).
- Jacobs, D. M., Gaudier, E., van Duynhoven, J., Vaughan, E. E. Non-digestible food ingredients, colonic microbiota and the impact on gut health and immunity: a role for metabolomics. Curr. Drug. Metab. 10, 41-54 (2009).
- Beckonert, O. High-resolution magic-angle-spinning NMR spectroscopy for metabolic profiling of intact tissues. Nat. Protoc. 5, 1019-1032 (2010).
- Hooper, L. V., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. . Methods in microbiology. 31, 559-589 (2002).
- Rahija, R. J., Fox, J. G. Ch. 7. The mouse in biomedical research. , 217-234 (2007).
- Goodwin, B. L., Ruthven, C. R., Sandler, M. Gut flora and the origin of some urinary aromatic phenolic compounds. Biochemical Pharmacology. 47, 2294-2297 (1994).
- Koopman, J. P. ‘Normalization’ of germfree mice after direct and indirect contact with mice having a ‘normal’ intestinal microflora. Lab Anim. 20, 286-290 (1986).
- Nishikata, N., Shikata, N., Kimura, Y., Noguchi, Y. Dietary lipid-dependent regulation of de novo lipogenesis and lipid partitioning by ketogenic essential amino acids in mice. Nutrition and Diabetes. 1, 1-12 (2011).
- Spagou, K. A GC-MS metabolic profiling study of plasma samples from mice on low- and high-fat diets. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci. 879, 1467-1475 (2011).
- Sanchez-Patan, F., Monagas, M., Moreno-Arribas, M. V., Bartolome, B. Determination of microbial phenolic acids in human faeces by UPLC-ESI-TQ MS. J. Agric. Food. Chem. 59, 2241-2247 (2011).
- Roux, A., Lison, D., Junot, C., Heilier, J. F. Applications of liquid chromatography coupled to mass spectrometry-based metabolomics in clinical chemistry and toxicology: A review. Clin. Biochem. 44, 119-135 (2011).
- Ryan, D., Robards, K., Prenzler, P. D., Kendall, M. Recent and potential developments in the analysis of urine: a review. Anal. Chim. Acta. 684, 8-20 (2011).
- Nagayama, K., Wuthrich, K., Bachmann, P., Ernst, R. R. Two-dimensional J-resolved 1H n.m.r. spectroscopy for studies of biological macromolecules. Biochem. Biophys. Res. Commun. 78, 99-105 (1977).
- Aue, W. P., Bartholdi, E., Ernst, R. R. Two-dimensional spectroscopy. Application to nuclear magnetic resonance. J. Chem. Phys. 64, 2229-2246 (1975).
- Bodenhausen, G., Ruben, D. J. Natural abundance 15N NMR by enhanced heteronuclear spectroscopy. Chemical. Physics. Letters. 69, 185-189 (1980).
- Fan, T. W. -. M. Metabolite profiling by one- and two-dimensional NMR analysis of complex mixtures. Progress in nuclear magnetic resonance spectroscopy. 28, 161-219 (1996).
- Fan, T., Lane, A. Structure-based profiling of metabolites and isotopomers by NMR. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 52, 48-48 (2008).
- Fonville, J. M. The evolution of partial least squares models and related chemometric approaches in metabonomics and metabolic phenotyping. Journal of Chemometrics. 24, 636-649 (2010).
- Merrifield, C. A. A metabolic system-wide characterisation of the pig: a model for human physiology. Mol. Biosyst. , (2011).
- Tugnoli, V. Molecular characterization of human gastric mucosa by HR-MAS magnetic resonance spectroscopy. International Journal of Molecular Medicine. 14, 1065-1071 (2004).
- Sitter, B. Comparison of HR MAS MR spectroscopic profiles of breast cancer tissue with clinical parameters. NMR Biomed. 19, 30-40 (2006).
- Beckonert, O. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat. Protoc. 2, 2692-2703 (2007).
