Het beoordelen van de lever metabole veranderingen tijdens Progressieve kolonisatie van Kiemvrije Mouse door 1 H NMR-spectroscopie
Summary
Een progressieve kolonisatie procedure wordt beschreven om nader te beoordelen de impact ervan op de host levermetabolisme. Colonization is gecontroleerd non invasief door het evalueren van de urinaire excretie van microbiële metabolieten door co-NMR-based metabool profiel, terwijl levermetabolisme wordt beoordeeld door de hoge resolutie Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR profilering van intact biopsie.
Abstract
Het is bekend dat darmbacteriën belangrijke bijdrage leveren aan de host-homeostase en biedt een scala aan voordelen, zoals bescherming van het immuunsysteem en vitamine synthese. Zij verzorgen ook de gastheer met een aanzienlijke hoeveelheid aan voedingsstoffen, waardoor dit ecosysteem een essentiële metabolische orgaan. In de context van steeds meer bewijs van het verband tussen de darmflora en het metabool syndroom, het begrip van de metabole interactie tussen de gastheer en zijn darmflora is steeds een belangrijke uitdaging van de moderne biologie. 1-4
Kolonisatie (ook wel aangeduid als normalisatie proces) wijst het opzetten van micro-organismen in een voormalige kiem-vrije dieren. Hoewel het een natuurlijk proces optreedt bij de geboorte, wordt het ook gebruikt bij volwassen kiemvrije dieren naar de darm bloemen ecosysteem-controle en verder bepalen de impact ervan op de host stofwisseling. Een gemeenschappelijke procedure om de kolonisatie procesbeheersing is om de maagsonde methode te gebruiken met een single of een mengsel van micro-organismen. Deze methode resulteert in een zeer snelle kolonisatie en presenteert het nadeel van de uiterst stressvolle 5. Daarom is het nuttig om de stress te minimaliseren en een tragere kolonisatie proces te krijgen geleidelijk houden aan de invloed van bacteriële vestiging op de host stofwisseling.
In dit manuscript beschrijven we een procedure om de wijziging van metabolisme in de lever te beoordelen tijdens een geleidelijke kolonisatie proces met behulp van een niet-destructieve metabool profiel techniek. Wij stellen voor om darm microbiële kolonisatie monitor aan door het beoordelen van de darm microbiële metabolische activiteit weerspiegeld door de urinaire excretie van microbiële co-metabolieten door een H NMR-based metabool profiel. Hierdoor kan een appreciatie van de stabiliteit van de darm microbiële activiteit buiten de stal oprichting van de darm microbiële ecosysteem meestal bepaald door het bewaken van fecale bacteriën door DGGE (denaturerende gradiënt gel elektroforese). 6 Dekolonisatie vindt plaats in een conventionele open omgeving en wordt geïnitieerd door een vuile nest bevuild door middel van conventionele dieren, die zal dienen als controle. Knaagdieren worden coprophagous dieren, dit zorgt voor een homogene kolonisatie zoals eerder beschreven. 7
Hepatische metabool profiel wordt direct gemeten vanaf een intacte lever biopsie met behulp van een H met hoge resolutie Magic Angle Spinning NMR spectroscopie. Deze semi-kwantitatieve techniek biedt een snelle manier om te beoordelen, zonder beschadiging van de celstructuur, de belangrijkste metabolieten zoals triglyceriden, glucose en glycogeen om verdere raming van de complexe interactie tussen de kolonisatie proces en het levermetabolisme 7-10. Deze methode kan ook worden toegepast op elk weefsel biopsie 11,12.
Protocol
Discussion
In dit protocol beschreven we een progressieve kolonisatie procedure in een open omgeving om verder te onderzoeken de impact van de darmflora op levermetabolisme beoordeeld door een H-HR-MAS NMR profilering van intacte biopsie. Verschillende methoden van kolonisatie zijn beschreven in de literatuur. De meest voorkomende methoden om dieren te koloniseren met een gedefinieerde microbiota zijn orale sondevoeding of verontreinigd drinkwater 19,20. Fecale inoculatie kan ook gebruikt worden zoals hiervoo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle NMR spectra gebruikt als illustratieve voorbeelden zijn ontleend aan een eerder gepubliceerde studie 7, die financieel werd ondersteund door Nestle.
Materials
Table of specific reagents and equipment:
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| 2.5 mm microtube | New Era | NE-H5/2.5-V-Br | |
| 1.7 mm capillary tube | Sigma-Aldrich | NORS175001 | |
| Capillary adapter | New Era | NE-325-5/1.7 | |
| Extraction rod | New Era | NE-341-5 | |
| HR-MAS rotor BL4 with 50 μL spherical Teflon spacer kit |
Bruker | HZ07213 | |
| Tool kit for 50 μL inserts | Bruker | B2950 | |
| Advance III 600 MHz NMR | Bruker | ||
| 1H HR MAS NMR solid probe | Bruker | ||
| Deuterium oxide 99.9 % | Sigma-Aldrich | 530867-1L | |
| 3-(trimethylsilyl)propionic acid-d4 (TSP) |
Sigma-Aldrich | 269913 |
References
- Cani, P. D., Delzenne, N. M. Gut microflora as a target for energy and metabolic. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 10, 729-734 (2007).
- Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444, 1022-1023 (2006).
- Raoult, D. Obesity pandemics and the modification of digestive bacterial flora. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 27, 631-634 (2008).
- Turnbaugh, P. J., Backhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-induced obesity is linked to marked but reversible alterations in the mouse distal gut microbiome. Cell. Host. Microbe. 3, 213-223 (2008).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 43, 42-51 (2004).
- Muyzer, G., Smalla, K. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Antonie van Leeuwenhoek. 73, 127-141 (1998).
- Claus, S. P. Colonization-induced host-gut microbial metabolic interaction. MBio. 2, (2011).
- Waters, N. J. High-resolution magic angle spinning 1H NMR spectroscopy of intact liver and kidney: optimization of sample preparation procedures and biochemical stability of tissue during spectral acquisition. Anal. Biochem. 282, 16-23 (2000).
- Bollard, M. E. High-resolution 1H and 1H-13C magic angle spinning NMR spectroscopy of rat liver. Magnetic resonance in medicine. 44, 201-207 (2000).
- Lindon, J. C., Holmes, E., Nicholson, J. Pattern recognition methods and applications in biomedical magnetic resonance. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 39, 1-40 (2001).
- Tate, A. R. Distinction between normal and renal cell carcinoma kidney cortical biopsy samples using pattern recognition of (1)H magic angle spinning (MAS) NMR spectra. NMR. Biomed. 13, 64-71 (2000).
- Wang, Y. Topographical variation in metabolic signatures of human gastrointestinal biopsies revealed by high-resolution magic-angle spinning 1H NMR spectroscopy. Journal of Proteome Research. 6, 3944-3951 (2007).
- Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times. The review of scientific instruments. 29, 688-691 (1958).
- Nicholson, J. K., Holmes, E., Wilson, I. D. Gut microorganisms, mammalian metabolism and personalized health care. Nat. Rev. Microbiol. 3, 431-438 (2005).
- Martin, F. P. Effects of probiotic Lactobacillus paracasei treatment on the host gut tissue metabolic profiles probed via magic-angle-spinning NMR spectroscopy. Journal of Proteome Research. 6, 1471-1481 (2007).
- Swann, J. R. Variation in Antibiotic-Induced Microbial Recolonization Impacts on the Host Metabolic Phenotypes of Rats. J. Proteome. Res. , (2011).
- Jacobs, D. M., Gaudier, E., van Duynhoven, J., Vaughan, E. E. Non-digestible food ingredients, colonic microbiota and the impact on gut health and immunity: a role for metabolomics. Curr. Drug. Metab. 10, 41-54 (2009).
- Beckonert, O. High-resolution magic-angle-spinning NMR spectroscopy for metabolic profiling of intact tissues. Nat. Protoc. 5, 1019-1032 (2010).
- Hooper, L. V., Sansonetti, P., Zychlinsky, A. . Methods in microbiology. 31, 559-589 (2002).
- Rahija, R. J., Fox, J. G. Ch. 7. The mouse in biomedical research. , 217-234 (2007).
- Goodwin, B. L., Ruthven, C. R., Sandler, M. Gut flora and the origin of some urinary aromatic phenolic compounds. Biochemical Pharmacology. 47, 2294-2297 (1994).
- Koopman, J. P. ‘Normalization’ of germfree mice after direct and indirect contact with mice having a ‘normal’ intestinal microflora. Lab Anim. 20, 286-290 (1986).
- Nishikata, N., Shikata, N., Kimura, Y., Noguchi, Y. Dietary lipid-dependent regulation of de novo lipogenesis and lipid partitioning by ketogenic essential amino acids in mice. Nutrition and Diabetes. 1, 1-12 (2011).
- Spagou, K. A GC-MS metabolic profiling study of plasma samples from mice on low- and high-fat diets. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci. 879, 1467-1475 (2011).
- Sanchez-Patan, F., Monagas, M., Moreno-Arribas, M. V., Bartolome, B. Determination of microbial phenolic acids in human faeces by UPLC-ESI-TQ MS. J. Agric. Food. Chem. 59, 2241-2247 (2011).
- Roux, A., Lison, D., Junot, C., Heilier, J. F. Applications of liquid chromatography coupled to mass spectrometry-based metabolomics in clinical chemistry and toxicology: A review. Clin. Biochem. 44, 119-135 (2011).
- Ryan, D., Robards, K., Prenzler, P. D., Kendall, M. Recent and potential developments in the analysis of urine: a review. Anal. Chim. Acta. 684, 8-20 (2011).
- Nagayama, K., Wuthrich, K., Bachmann, P., Ernst, R. R. Two-dimensional J-resolved 1H n.m.r. spectroscopy for studies of biological macromolecules. Biochem. Biophys. Res. Commun. 78, 99-105 (1977).
- Aue, W. P., Bartholdi, E., Ernst, R. R. Two-dimensional spectroscopy. Application to nuclear magnetic resonance. J. Chem. Phys. 64, 2229-2246 (1975).
- Bodenhausen, G., Ruben, D. J. Natural abundance 15N NMR by enhanced heteronuclear spectroscopy. Chemical. Physics. Letters. 69, 185-189 (1980).
- Fan, T. W. -. M. Metabolite profiling by one- and two-dimensional NMR analysis of complex mixtures. Progress in nuclear magnetic resonance spectroscopy. 28, 161-219 (1996).
- Fan, T., Lane, A. Structure-based profiling of metabolites and isotopomers by NMR. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 52, 48-48 (2008).
- Fonville, J. M. The evolution of partial least squares models and related chemometric approaches in metabonomics and metabolic phenotyping. Journal of Chemometrics. 24, 636-649 (2010).
- Merrifield, C. A. A metabolic system-wide characterisation of the pig: a model for human physiology. Mol. Biosyst. , (2011).
- Tugnoli, V. Molecular characterization of human gastric mucosa by HR-MAS magnetic resonance spectroscopy. International Journal of Molecular Medicine. 14, 1065-1071 (2004).
- Sitter, B. Comparison of HR MAS MR spectroscopic profiles of breast cancer tissue with clinical parameters. NMR Biomed. 19, 30-40 (2006).
- Beckonert, O. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat. Protoc. 2, 2692-2703 (2007).
