臍帯血から細胞傷害性Tリンパ球の拡大をそのターゲットサイトメガロウイルス、エプスタイン - バーウイルス、およびアデノウイルス
1Center for Cell and Gene Therapy,Baylor College of Medicine , 2Pathology and Immunology,Baylor College of Medicine , 3Department of Stem Cell Transplantation and Cellular Therapy,University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, 4Medicine,Baylor College of Medicine , 5Department of Pediatrics,Baylor College of Medicine
Summary
ここでは、最初の良い製造基準（GMP）に準拠した臍帯血、主にナイーブT細胞のソースからウイルス特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を製造する方法を説明します。
Abstract
幹細胞移植後のウイルス感染は、特にCBは感染から受信者を保護することができ、ウイルス経験豊富なT細胞のかなりの数字を含まない臍帯血（CB）移植（CBT）の後に、死の最も一般的な原因の一つである1 –我々や他のウイルス特異的CTL抗体陽性ドナーから生成され、受信者に注入が安全かつ保護的であることが示されている。5-8しかし、最近まで、ウイルス特異的T細胞が臍帯血から生成することができませんでした、おそらくのために4ウイルス特異的メモリーT細胞が存在しない。
良いナイーブT細胞の in vivoでのプライミング条件で模倣するための努力で、我々は、したがってT細胞特異性を駆動する、CB由来樹状細胞（DC）は免疫CMV抗原pp65抗原を含むアデノウイルスベクター（Ad5f35pp65）で形質導入に使用する方法を確立し開始時9。CMV、およびアデノウイルスに向かって、我々はこれらのmaを使うtured樹と同様に、CB由来T細胞サイトカインの存在下で、IL-7、IL-12およびIL-15 10我々は両方を発現するEBV形質転換B細胞、またはEBV-LCLを、使用される第二の刺激で潜伏と溶解EBV抗原。 Ad5f35pp65形質のEBV-LCLは第2の刺激でのIL-15の存在下でT細胞を刺激するために使用されます。後続の刺激は、EBV-LCLおよびIL-2 Ad5f35pp65形質を使用しています。
50×10 6、CB単核細胞から、我々は抗原刺激に応答して、抗原をパルス目標とリリースサイトカインを溶解さ150×10 6のウイルス特異的T細胞の上方に生成することができます。11これらの細胞は、使用して、GMPに準拠した方法で製造されただけ画し臍帯血ユニットの20％画分および臨床使用のために翻訳されています。
Protocol
1。単核細胞分離（0日目） 臍帯血ユニットの20％分の出口ポートにメスルアーアダプタのスパイクを挿入し、シリンジを接続して、血液を除去する。 50 mLの遠心分離管中で温めたRPMI 20mLに解凍した血液を転送します。 RPMI 5mLで臍帯血袋を洗浄し、同じ遠心チューブに移す。 400 x gで10分間細胞を遠心分離します。上清を吸引します。 暖かいRPMI 20mlに細胞を再懸濁する。 50…
Discussion
CBTの後にウイルス感染を制御することを目的と現在の戦略が効果的ですが、彼らはかなりの毒性に関連付けられている、高価なもので、その後の感染症に対する長期の保護を与えない。実際には、いくつかの抗ウイルス薬の使用は、他の方法で保護されるであろうウイルス特異的T細胞の増殖を制限することがあります。14もう一つのオプションは、ドナー由来のウイルス特異的T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ダン·L·ダンカン共同研究助成金（CMBとEJS）、国立心肺血液研究所（US4HL081007）、白血病とリンパ腫協会臨床研究奨学生賞（CMB）、および国立癌研究所によってサポートされていました（RO1 CA06150816; EJS）。
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-076 |
| DC media | CellGenix | 20801-0500 |
| EHAA (Click’s Medium) | Irvine Scientific | 9195 |
| Human Serum | Gemini Bio Products | 100-110 |
| Gas Permeable Cultureware18 | Wilson-Wolf | 80040S |
| IL-2 | Chiron (TCH Pharmacy) | |
| IL-12 | NCI/CTEP | |
| IL-15 | CellGenix | 1013-050 |
| IL-7 | R&D | AFL207 |
| IL-1beta | R&D | AFL201 |
| IL-6 | CellGenix | 1004-050 |
| GM-CSF | TCH Pharmacy | |
| IL-4 | R&D | AFL204 |
| TNF-alpha | R&D | AFL210 |
| Ad5f35pp65 | BCM CAGT Vector Production Facility | |
| Plasma transfer set with female luer adapter | Charter Medical | 89-550-66j |
| Lymphoprep | Nycomed | 1114550 |
References
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Cite This Article
Hanley, P. J., Lam, S., Shpall, E. J., Bollard, C. M. Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus. J. Vis. Exp. (63), e3627, doi:10.3791/3627 (2012).