De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

1. Células cultura MDCK Cultura 5 millones de células MDCK durante la noche en un T-75 cm 2 matraz en 20 ml de medio RPMI1640 completa con FBS al 10%, 100 U / ml penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 1 mM piruvato de sodio, 5% de bicarbonato de sodio 7,5% solución y el 0,001% β-mercaptoetanol en una incubadora a 37 ° C infundido con el 5,2% de CO 2. 2. PR8 infección y acumulación de líquido BAL Desafío C57BL / 6 ratones por vía intranasal con 5.000 PFU de PR8 virus en PBS estéril en un volumen total de 30 l a través de una ventana de la nariz. Llevar a cabo simulacros de infecciones utilizando sólo PBS estéril sin el virus. La eutanasia de los ratones 0, 2, 4 y 7 días después de la infección y reducir la cavidad torácica, abrir y hacer un paralelo de 1 cm de la incisión en la tráquea a través de la piel del ratón para exponerlo. Hacer una incisión en la parte proximal de la tráquea. Infundir la tráquea con 0,5 ml de PBS-1% de BSA y aspire el BAL fluido. BAL fluidos puede ser almacenada en congelador a -20 ° C hasta su utilización. 3. Virus de la infección y la detección de proteína de la matriz viral (M2) con la Odisea LI-COR Para cuantificar los títulos virales que utilizan rayos infrarojos de tinte conjugado con anticuerpos, cosechar las células MDCK de T-75 cm 2 frascos y la placa en el fondo negro mate óptica de 96 pocillos (10.000 células por pocillo) o 384 pocillos (5.000 células por pocillo ) placas. Cultura las células MDCK para durante la noche a 37 ° C en medio RPMI1640 completa y lavar dos veces con suero libre de DMEM que contenía BSA (0,2%, peso / volumen), penicilina (100 U / ml), estreptomicina (100 ug / ml), sodio piruvato (1 mM), solución de bicarbonato sódico (5% del 7,5%) y β-mercaptoetanol (0,001%). Se incuban las células MDCK con el líquido de BAL (50 l para la placa de 96 pocillos o de l 10 por 384 y placa) o PR8 virus con títulos conocidos en cada pocillo con el mismo volumen (50 l para la placa de 96 pocillos o 10 l de 384 – así placa) de medio DMEM,que contiene L-1-tosylamido-2-feniletilo clorometilcetona (TPCK)-tratada tripsina (0,2 g / ml). Tras 1 h de infección, añadir 100 ml (96-así placa) o 20 l (384-así placa) de 10% de SFB-que contiene medio RPMI1640 completa a cada pocillo. Continuar el cultivo de células MDCK para otra h 16 de la infección; lavar las células MDCK dos veces con 100 l (96-así placa) o 20 l (384-así placa) de PBS-1 solución de BSA% y fijar con 100 l (96-así placa) o 20 l (384-así placa) de 1% de paraformaldehído durante 5 min. A raíz de fijación, incubar las células MDCK aún más durante 30 minutos con 100 l (96-así placa) o 20 l (384-así placa) de PBS-1% de BSA para bloquear. Después de bloquear incubar las células MDCK durante 1 h con el anticuerpo primario contra la proteína M2 (1:1000, se diluyó en PBS-1% de BSA). Utilice 50 l por l bien y 20 de anticuerpo diluido por pocillo en 96-bien o bien 384-placas, respectivamente. Lavar las células MDCK tres veces con 100 l (placa de 96 pocillos) O 20 l (384-así placa) de PBS-que contiene 1% de BSA y se incuba durante 1 h con 50 l (96-así placa) o 20 l (384-así placa) de cabra anti-ratón IRDye @ 800 anticuerpo secundario ( dilución 1:200). Lavar las células MDCK tres veces con 100 l de PBS-que contiene BSA al 1%. Coloque las placas teñidas en la plataforma de cristal de la lectura de la LI-COR Odyssey escáner de infrarrojos y configurar el lector de un 96 – o la lectura de la placa de 384 pocillos. Pocillos de control negativo en blanco se puede ajustar mediante el software Odyssey LI-COR. Cuantificar la placa total o pozos seleccionados dentro de la placa utilizando el software LI-COR Odisea. Uso de la herramienta de formas automáticas, trazar los límites de una región de destino (ROI) en medio de un pozo de prueba de 96 – o placas de 384 pocillos. Creación de retorno de la inversión permite que el software para comparar los pozos de fondo definidas a las muestras tituladas virus-. Para establecer el valor de referencia para el ensayo general, utilizar un retorno de la inversión del fondo. Introducir las dos que se opongan cruces proporcionados por el software de la Odisea en el retorno de la inversión a la medivolver a la intensidad de la fluorescencia a través del pozo. Escanear utilizando placas de 780 nm para la detección de canales y 680 nm como longitud de onda de referencia en un LI-COR Odyssey escáner de infrarrojos. Una vez que el comando 'Leer' se activa, la intensidad de fluorescencia a intervalos uniformes del retorno de la inversión se medirá y los datos recogidos integrada puntos. Un multiplicador desviación estándar determinará el nivel de señal sobre la línea de base que se incluye en la determinación del ROI. Fluorescencia de fondo, se cuantificarán a partir del anticuerpo maqueta infectada o secundaria solo controla y será utilizada para estimar la intensidad integrada en pozos de prueba. Elija 'intensidad integrada' para los cálculos, ya que representa el volumen neto de pixel por un lugar definido individual y es independiente del tamaño de la característica. Use la curva estándar a partir de los títulos virales conocidas para calcular los títulos virales de muestras desconocidas. Utilice una larga curva de interpolación para calcular con precisión los títulos virales. Calcular la vlos títulos de iral en las muestras de ensayo mediante la comparación de las intensidades de las muestras de ensayo con la curva estándar. 4. Los resultados representativos Normalización de IR con base de tinte sistema de detección de rendimiento viral alta PR8 virus puede infectar a las células MDCK; por lo tanto, hemos utilizado estas células para desarrollar este ensayo. Se midieron los títulos virales utilizando un anticuerpo primario contra una proteína vírica de la gripe matriz (M2). En contraste con otras metodologías, hemos utilizado un anticuerpo secundario que se conjuga con un tinte de IR cercano. Este método proporciona una forma simple y automatizada PR8 la determinación del título del virus con la intensidad de fluorescencia que se genera cuando se detecta la proteína M2. Después de la infección por virus de la influenza, la proteína M2 está traducido, que se transportan y se acumula en la célula huésped incluyendo la superficie celular. Así, la cantidad de la proteína M2 representa un parámetro medible para determinar la cantidad del virus. La comparación de las intensidades delas muestras de ensayo con la curva estándar proporciona la medición precisa de los títulos virales. Para determinar la eficacia del método basado en la fluorescencia, nos culta 10 4 células MDCK / así en la cámara se desliza durante la noche. PR8 poblaciones virales de títulos conocidos se añadieron a pocillos por duplicado con las unidades formadoras de placa diferentes (UFP) y se dejó para adsorberse sobre las células durante una hora. Las células fueron incubadas durante 16 h para permitir que el virus para propagarse. Después de esto, las células MDCK en las cámara de diapositivas fueron fijadas con paraformaldehído al 1%, se lavaron y se tiñeron con anti-M2 anticuerpo durante 1 h, seguido por AlexaFluor 488-anticuerpo secundario conjugado para un adicional de 1 h. Confocal análisis microscópicos de células infectadas MDCK demostrado la monocapa adherente era en gran parte intacta y la proteína M2 PR8-derivada fue abundantemente presente dentro de las células infectadas MDCK (Figura 1A). Células fluorescentes podría ser detectada en las infecciones con títulos virales tan bajo como 10 2 </sup>. Estos análisis también reveló que el número de células fluorescentes MDCK por así eran directamente proporcionales a las crecientes PR8 títulos virales. Aunque, la eficiencia óptica de excitación láser de argón-basado fluorocromo proporciona vívidas imágenes celulares, su señal estrecho a ruido y la autofluorescencia de las células rendir cuantificaciones virales extremadamente difíciles, particularmente a bajas titulaciones. Por lo tanto, para establecer un método preciso de estimación virales que emplean un IR con base de tinte sistema de detección y cuantificación. Células MDCK (10 4 / pocillo) se cultivaron en placas de 96-así, infectados con PR8 y proteínas virales se detectaron utilizando anti-M2 seguido por un tinte de IR-anticuerpo secundario conjugado. El uso de anticuerpos anti-M2 nos permitió utilizar la intensidad de fluorescencia antígeno-específica como un indicador directo de la cantidad de virus. Para enumerar la intensidad de fluorescencia, se utilizó el LI-COR Odyssey basado en escáner de infrarrojos. Este sistema utiliza dos canales de láser-based detecciones infrarrojas para identificar fluoróforos y diferenciarlos del ruido de fondo. El primer canal excita a 680 nm y emite a 700 nm para ayudar a cuantificar el fondo. El segundo canal detecta fluoróforos que excitan a 780 nm y emisión a 800 nm. Escaneo de PR8-las células infectadas MDCK en LI-COR Odisea indicó un título viral dependiente de fluorescencia brillante (Figura 1B). M2 positivos células MDCK fluorescentes eran claramente visibles dentro de los pozos (Figura 1B). Una correlación positiva de intensidad de fluorescencia a título del virus a partir de 10 2 -10 5 UFP podría ser observado constantemente. PR8 titulaciones virales más alto que 10 6 UFP plomo a la muerte celular, que establece un límite superior para la sensibilidad del ensayo. Positividad mínima detectable, pero siempre visto con 10 2 -10 3 UFP PR8 títulos virales demostrado la alta sensibilidad de los tintes de infrarrojo cercano. La relación señal-ruido se determinó mediante la comparación de la mock-infectados o isotipo tratados con anticuerpo-células MDCK. Ambos de estos controles resultó en niveles insignificantes o indetectables de fluorescencia (Figura 1B). Para mejorar aún más la sensibilidad y para reducir los requerimientos de la muestra de prueba de volumen, se infectaron 5 × 10 3 células MDCK / pocillo en placas de 384 pocillos. UFP Diferentes de PR8 se ensayaron como seriales uno diluciones de registro (Figura 1C). Sensibilidad de detección a partir de placas 384-así era comparable a la de los ensayos de placa 96-así. Tanto 10 1 y 10 2 UFP trabajado consistentemente mejor en las placas de 384 pocillos en comparación con placas de 96 pocillos. Uso de las intensidades de fluorescencia de 96 – o formatos de placas de 384 pocillos, se construyeron las curvas estándar de valoración (Figura 1D). En estos cálculos, la primera variable es el título viral, mientras que la segunda variable es la intensidad de la fluorescencia. Por lo tanto, hemos utilizado la distribución exponencial para generar una curva de ajuste a determel INE relación polinomio entre los títulos virales e intensidades de fluorescencia. También hemos validado nuestras observaciones utilizando otro anticuerpo que se dirige contra la nucleoproteína (NP) de PR8 virus A (datos no presentados). Distintas fuentes de PR8 cepas también fueron utilizados para infectar las células MDCK que fueron probados con anticuerpos anti-NP o anti-M2 anticuerpos (datos no presentados). En conjunto, llegamos a la conclusión de que IR con base de tinte sistema de detección de la proteína puede ayudar a diagnosticar las cepas de virus infectante y precisa enumerar el título de los patógenos que infectan. Consideraciones matemáticas para el cálculo de los títulos virales Los cálculos matemáticos de la intensidad de la fluorescencia y determinaciones del título se hace como se describe a continuación. Siguiendo el procedimiento de tinción, la placa entera o pozos seleccionados dentro de la placa se cuantificó usando el software LI-COR Odisea. Uso de la herramienta de formas automáticas, los límites de una región de destino (ROI) se ha elaborado en el centro de los pozos de prueba de 96 – ó 384 que-placas LL (Figura 2A y B). Creación de retorno de la inversión permite que el software para comparar los pozos de fondo definidas a las muestras tituladas virus-. Un retorno de la inversión de fondo se utilizó para establecer el valor de referencia para todo el ensayo. Dos en contra de mira (blanco) se introdujeron en el retorno de la inversión para medir la intensidad de la fluorescencia en el pozo (Fig. 2C). Curvas según el lado derecho y debajo de los pozos representativos en la Figura 2C representan la intensidad de los píxeles a lo largo de estos pelos cruzadas. Las intensidades fluorescentes a intervalos uniformes del retorno de la inversión fueron medidos y los puntos de datos recogidos fueron integrados. Un multiplicador de la desviación estándar determina el nivel de señal en la línea de base que se incluyó en la determinación de retorno de la inversión. Antecedentes de fluorescencia se cuantificó a partir del anticuerpo maqueta infectada o secundaria solo controles y se utiliza para estimar la intensidad integrada en pozos de prueba. Elegimos intensidad integrada para el cálculo, ya que la represiónvolumen padres píxel neto para un punto individual definido y es independiente del tamaño de la característica. Además, la intensidad integrada es sustancialmente independiente de la resolución. Intensidad total / píxel (I) corresponde a la intensidad de la señal derivada de la. Seleccionado bien en el área de píxeles (Is), además de la señal que surge desde el fondo del área de píxeles (b) Por lo tanto, para el píxel 'i': I i = s i + b i Volumen Pixel representa tanto la magnitud de la señal y la zona en que se distribuye. Área de señal está relacionada con la distribución de la muestra que está generando la señal. El volumen de píxeles es igual al total de la señal se mide en píxeles "yo" en el área (a) del píxel veces su altura (I). Así que por píxel 'i': vi = un I i El volumen total de píxeles es la suma de total de la señal de toda la zona así: ; n n V = Σv i = aΣI i i = 1 i = 1 Intensidad integrada es la suma de los valores de intensidad de todos los píxeles encerrados por rasgo, multiplicado por el área del círculo / rectángulo (mm recuento 2). Por lo tanto, la intensidad integrada = un (ΣI i – b) En este caso, b representa la intensidad de fondo promedio de los pixeles. Esta fórmula calcula las intensidades de señal integrados del control o pozos experimentales y así se establece una curva estándar. Los títulos virales en las muestras de ensayo se calcularon utilizando esta curva estándar. Concentración (de intensidad) se define como la cantidad de fluorescencia presente en un ROI definido. Las concentraciones en muestras de ensayo son cálculosTed relativa a las concentraciones definidas de los estándares en la misma imagen. Para calcular los títulos virales precisas, la intensidad de cada estándar de concentración se traza y equipado con una curva de interpolación de largo. Las concentraciones de las muestras de ensayo se calculan comparando la intensidad de la zona dentro de la curva estándar. Determinación de los títulos virales en el líquido de BAL de ratones infectados con la gripe La detección de partículas virales de la gripe vivos en muestras clínicas y de laboratorio es de importancia fundamental. Por lo tanto, el próximo examinó si podemos utilizar este método para determinar los títulos virales en muestras de laboratorio. BAL fluidos se obtuvieron de ratones no vacunados que se ha inyectado una cantidad conocida de PR8 virus. Pinchos BAL fluidos se valora de forma lineal para la enumeración de los títulos virales. Alícuotas de pinchos BAL fluidos fueron utilizados para infectar las células MDCK en placas de 96-así, fijadas y teñidas con anti-M2 e IR tinte-conjugado secondarY anticuerpos. Los resultados mostrados en la Figura 3A demostrar que los títulos virales en el líquido de BAL claveteado fueron detectables y se correlacionó con los PR8 títulos en la curva estándar. Utilizando la curva de calibración, precisas número de virus en el líquido se disparó y se titula BAL se cuantificó. Exponenciales cálculos de ajuste de curva proporcionado una medida para calcular los títulos virales en el líquido claveteado BAL (Figura 3B). A través de este método se obtuvieron excelentes correlaciones entre los títulos virales calculados y se disparó, la validación de este método (Figura 3C). A continuación, analizamos el líquido de BAL de PR8-ratones infectados. PR8 ha sido ampliamente utilizado en modelos murinos para comprender la inmunidad humana 3 patología y anti-virales. Los grupos de ratones fueron infectados por vía intranasal con 5.000 PFU de PR8. Los ratones fueron controlados por la pérdida de peso, la apariencia de la espalda encorvada, pelo rizado y otros síntomas clínicos. En los días 0, 2, 4, 7 y 10 de post infección,ratones fueron sacrificados y BAL fluidos recolectados fueron. Para utilizar las muestras de laboratorio, las células MDCK se incubaron con diluciones seriadas de fluido BAL en un volumen final de 50 l para 17 h en 96-y placas. Los pocillos de control de las células MDCK infectadas con títulos conocidos de imágenes de stock PR8 virus servido para generar una curva estándar. Después de la infección, las células fueron lavadas, fijadas y teñidas con anti-M2 anticuerpo primario seguido de cerca-IR tinte-anticuerpo secundario conjugado. Células MDCK que fueron infectadas maqueta o tratados con controles de isotipo después de la infección siempre y cuando las intensidades de fluorescencia de fondo para el cálculo de título. Los análisis de la BAL líquido demostrado que PR8 un virus en el espécimen de laboratorio es detectable a través del sistema de ensayo de IR con base de tinte. Un aumento significativo en la carga viral en el líquido de BAL se observó en los días 2 y 4 después de la infección (Figura 4A). Los cálculos de intensidad integrada indicó que BAL fluidos de los días 2 y 4 de posteoNFECCIÓN contenía niveles significativos de PR8 virus (Figura 4B). Nuestros resultados muestran una pérdida de peso gradual pero significativo durante la fase temprana de PR8 infección, lo que demuestra la gravedad de la enfermedad. Sin embargo, la mayoría de los ratones empezaron a recuperarse de los síntomas de la enfermedad y aumentar de peso 7 días de la infección (Figura 4C). Los ratones en post infección día 10 carecía de cualquier PR8 detectable indicando el aclaramiento del virus, que también se correlacionó con el aumento en el peso corporal y reducciones considerables en los síntomas de la enfermedad. Para ampliar aún más la aplicación de este ensayo, hemos probado un 2009 gripe A (H1N1) muestra humana con IR con base de tinte sistema de detección de anticuerpos y la comparó con en tiempo real PCR. Esta muestra clínica se aisló de un hisopo nasofaríngeo combinado / garganta obtenido a partir de paciente sospechoso. El aislamiento se propagó en la línea celular MDCK en el Laboratorio del Departamento de Salud de Milwaukee. Los resultados del ensayo eran comparojo para comprobar la sensibilidad de la IR con base de tinte método a tiempo real ensayos de PCR (Figura 5). Los resultados indican que el IR con base de tinte sistema de detección de anticuerpos tiene el potencial para detectar la carga viral tan bajo como 10 3 DICT 50 / ml, que es comparable a la PCR-ensayo basado en (10 DICT 50 / ml) y caída dentro de la relevancia clínica rango para la mayoría de las muestras de paciente. Estos resultados proporcionan una fuerte evidencia de que el IR con base de tinte sistema de ensayo tiene la suficiente sensibilidad y potencial de ser aplicado para la enumeración de título viral en el laboratorio de investigación y clínicas. Figura 1. IR con base de tinte de detección inmunológica de virus de la influenza. (A) Confocal análisis microscópico de las células infectadas por la gripe MDCK en la cámara de diapositivas 8-así. Inmunofluorescencia análisis microscópicos demostrar la monocapa MDCK adherente es en gran parte intacto y cargado con el virus derivado de M2 de proteínas. (BC) La cuantificación de los títulos virales basadas en IR tinte y LI-COR sistema de Odyssey. (D) Generación de las curvas de calibración y ajuste de curva exponencial perfiles. Los datos presentados en el año son representativos de cinco experimentos independientes. Figura 2. Metodología de la determinación de los títulos virales que utilizan tintes de rayos infrarrojos. (A) mediciones integradas de intensidad de fluorescencia. Un área definida dentro de los pozos de prueba (ROI) fue marcado para medir la intensidad de fluorescencia. Uso de la herramienta de formas automáticas, fronteras de la ROI se elaboraron en el medio de los pozos de prueba de 96 – o placas 384-así. La fluorescencia se mide como píxeles individuales (píxel = n) en el retorno de la inversión. Intensidad integrada es la suma de los valores de intensidad de todos los píxeles encerrados por rasgo, multiplicado por el área del círculo / rectángulo (mm recuento 2). (B) La determinación de las intensidades integradas de fluorescencia en los pozos de ensayo. Creación de retorno de la inversiónpermitió que el escáner LI-COR para comparar los pozos de fondo definidas a las muestras tituladas virus-. Antecedentes de fluorescencia se cuantificó a partir del anticuerpo maqueta infectada o secundaria solo controles y se utiliza para estimar la intensidad integrada en pozos de prueba. (C) Colección de puntos de datos en el retorno de la inversión. Dos opuestos pelos cruzados (blanco) se introdujeron en el ROI para medir la intensidad de la fluorescencia a través del pozo. Curvas según el lado derecho y debajo de los pozos representativos representan la intensidad de los píxeles a lo largo de estos pelos cruzadas. Figura 3. Detección y cuantificación de los títulos de virus en el PR8 BAL fluidos con púas. (A) las células MDCK se cultivaron en placas de 96 pocillos durante la noche y añadió con PR8-pinchos LBA. Las placas se leyeron en el sistema Odyssey LI-COR. (B) exógenamente fluido BAL claveteado se comparó con las curvas de calibración. (C) Comparación de la calculada para VIR espera al títulos. Ajuste de la curva exponencial siempre y = 9.4784e 0.0014x. Los datos presentados en AC son representativos de tres experimentos independientes. Figura 4. Detección y cuantificación de virus de la gripe en los fluidos de BAL PR8 los ratones infectados. (A) Los grupos de ratones fueron infectados por vía intranasal con 5.000 PFU de PR8. Células MDCK se incubaron con diluciones seriadas de fluido BAL en un volumen final de 50 l para 17 h en 96-y placas. Después de la infección, las células fueron lavadas, fijadas y teñidas con anti-M2 anticuerpo primario seguido por IR tinte-anticuerpo secundario conjugado. El panel más a la derecha representa la curva estándar. (B) Cuantificación de los títulos virales en el líquido de BAL de ratones infectados. (C) La pérdida de peso de los ratones durante la infección por el PR8 correlacionada con la carga viral. Los datos presentados en AC son representativos de tres experimentos independientes. RE 5 "src =" / files/ftp_upload/3623/3623fig5.jpg "/> Figura 5. Detección y cuantificación de 2.009 A (H1N1) (PDM) de la gripe aislado de un paciente humano. (A) El IR con base de tinte de detección de anticuerpos del sistema de fluorescencia para doblar en la valoración de la línea celular MDCK infectados. Los resultados de fluorescencia indican que el ensayo tiene potencial para detectar la carga viral tan bajo como 10 3 DICT 50 / ml. (B) ácido nucleico extraído de la cultura aislar junto con seriales diez veces diluciones de A H1N1 conocidos dosificado aislado se analizaron con el CDC en tiempo real el ensayo de PCR 12. El límite de detección de PCR en tiempo real fue de 10 DICT 50 / ml.