Высокая пропускная способность Метод обнаружения для вируса гриппа

1. MDCK культуре клеток Культура 5000000 MDCK клеток в течение ночи в Т-75 см 2 колбы на 20 мл RPMI1640 полной среде с 10% FBS, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия, 5% до 7,5% бикарбоната натрия Решение и 0,001% β-меркаптоэтанол в 37 ° C инкубатор переплетаются с 5,2% CO 2. 2. PR8 инфекции и сбор жидкости БАЛ Проблема C57BL / 6 интраназально с 5000 PFU из PR8 вируса в стерильной PBS в общем объеме 30 мкл через одну ноздрю. Провести макет инфекций, используя только стерильный ФСБ без вируса. Эвтаназии 0 мышей, 2, 4 и 7 дней после заражения и сократить грудной полости открыть и сделать 1 см разрез параллельно трахеи через мех мыши раскрыть его. Сделайте срединный разрез на проксимальных аспект трахеи. Настаивать в трахею 0,5 мл PBS-1% BSA и аспирации BAL жидкости. BAL жидкости можно хранить в морозильной камере -20 ° C до использования. 3. Вирусной инфекции и выявления вирусных белков матрицы (М2) с LI-COR Odyssey Для количественной оценки вирусные титры использованием инфракрасного красителя конъюгированных антител, собрать MDCK клеток Т-75 см 2 колбах и пластины их в оптическом плоским дном черный 96-а (10000 клеток на лунку) или 384-а (5000 клеток на лунку ) пластин. Культуры клеток MDCK на ночь при 37 ° С в RPMI1640 полной среде и мыть дважды бессывороточной DMEM содержащих BSA (0,2% вес / объем), пенициллин (100 ЕД / мл), стрептомицин (100 мкг / мл), натрия пируват (1 мм), раствором бикарбоната натрия (5% 7,5%) и β-меркаптоэтанол (0,001%). Инкубируйте MDCK клеток БАЛ (50 мкл для 96-луночного планшета или 10 мкл для 384-луночного планшета) или PR8 вируса с известным титром в каждую лунку с равным объемом (50 мкл для 96-луночного планшета или 10 мкл на 384 – и пластины) среднего DMEM,, содержащие L-1-tosylamido-2-фенилэтил хлорметил кетонов (TPCK) обращению трипсина (0,2 мкг / мл). После 1 часа инфекции, добавьте 100 мкл (96-луночного планшета) или 20 мкл (384-луночный планшет) 10% FBS содержащие RPMI1640 полной среде в каждую лунку. Продолжить культивирования клеток MDCK еще 16 ч инфекции; мыть MDCK клеток в два раза с 100 мкл (96-луночного планшета) или 20 мкл (384-луночный планшет) в PBS-1% BSA решение и исправить с 100 мкл (96-а пластины) или 20 мкл (384-луночный планшет) 1% параформальдегида в течение 5 мин. После фиксации, инкубировать MDCK клеток дальнейшем в течение 30 минут с 100 мкл (96-луночного планшета) или 20 мкл (384-луночный планшет) в PBS-1% BSA для блокировки. После блокировки инкубации клеток MDCK в течение 1 ч с первичными антителами против белка М2 (1:1000 разводят в PBS-1% BSA). Используйте 50 мкл на лунку и 20 мкл разведенной антител в каждую лунку в 96-и или 384-луночных планшетов, соответственно. Вымойте MDCK клеток трижды по 100 мкл (96-луночного планшета) Или 20 мкл (384-луночный планшет) ФСБ, содержащим 1% BSA и инкубируют в течение 1 ч с 50 мкл (96-луночного планшета) или 20 мкл (384-луночный планшет) антимышиного IRDye @ 800 вторичными антителами ( 1:200 разведение). Вымойте MDCK клеток трижды по 100 мкл PBS-содержащим 1% BSA. Поместите окрашенные плиты на платформе чтения стекла LI-COR сканер Odyssey ИК и установить считыватель для 96 – или 384-луночного планшета чтения. Пустой отрицательный скважин управления может быть установлен с помощью LI-COR Odyssey программного обеспечения. Количественная целую тарелку или отдельных скважин в панели с помощью LI-COR Odyssey программного обеспечения. Использование автоматического инструмент Shape, рисовать границы целевой области (ROI) в середине теста также 96 – или 384-луночных планшетах. Создание ROI позволяет программное обеспечение для сравнения определены скважин фоне вируса титровать образцов. Для установки исходных значений в течение всего теста, использовать фон ROI. Введем два противоположных перекрестие предоставляемых Odyssey программного обеспечения в ROI для measuповторно интенсивность флуоресценции через скважины. Сканирование пластины с использованием 780 нм канал для обнаружения и 680 нм в качестве справочного волны в LI-COR сканер Odyssey ИК. После команды "прочитанные" активирована, люминесцентные интенсивности при равномерном интервалы ROI будет измеряться и собранных данных точек интеграции. Стандартный множитель отклонения определяют уровень сигнала на базовых, которые включаются в расчет ROI. Фоновой флуоресценции будет количественно от макета-инфицированных или вторичными антителами только контролирует и будет использоваться для оценки интегральной интенсивности в тестовой скважины. Выбрал "интегральной интенсивности для расчетов, поскольку она представляет собой чистую объем пикселей на определенный индивидуальный месте и не зависит от размера элемента. С помощью калибровочной кривой от известных вирусных титров для расчета вирусные титры неизвестных образцов. С помощью длинной кривой интерполяции точно рассчитать вирусные титры. Вычислить VИРАЛ титр в исследуемых пробах путем сравнения интенсивности образцов со стандартной кривой. 4. Представитель Результаты Стандартизация ИК на основе красителя высокая пропускная способность вирусной системы обнаружения PR8 вирус может заразить MDCK клеток, поэтому мы использовали эти клетки для развития этого анализа. Мы измерили вирусные титры использованием первичных антител против гриппа, вирусного белка матрицы (М2). В отличие от других методик, мы использовали вторичные антитела, которые сопряжена с ближней ИК-краситель. Этот метод обеспечивает простое, автоматизированное PR8 определение титра вируса использованием интенсивности флуоресценции, который создается при обнаружении белка М2. После вирусом гриппа, M2 белка переводится, транспортировались и накапливается в клетке-хозяине в том числе на поверхности клеток. Таким образом, количество белка М2 представляет собой измеряемый параметр для определения количества вируса. Сравнение интенсивности отобразцы со стандартной кривой обеспечивает точное измерение вирусные титры. Для того чтобы определить эффективность флуоресценции на основе метода, культурный 10 4 MDCK клеток / лунку в камере скользит в одночасье. PR8 вирусные акции известных титры были добавлены, чтобы дублировать скважин с различными бляшкообразующих единиц (БОЕ) и позволил адсорбируются клетками в течение одного часа. Клетки инкубировали в течение 16 часов, чтобы позволить вирусу распространяться. После этого MDCK клеток в камере слайды были установлены с 1% параформальдегида, промывают и окрашивают с анти-М2 антител в течение 1 ч, затем AlexaFluor 488-сопряженных вторичными антителами, для дополнительного 1 час. Конфокальный микроскопический анализ зараженных клеток MDCK продемонстрировали сторонник монослоя была в значительной степени нетронутыми и PR8 производные белка М2 была обильно присутствует внутри зараженных клеток MDCK (рис. 1А). Флуоресцирующих клетки могут быть обнаружены в инфекции вирусные титры столь же низко как 10 2 </sup>. Эти исследования также показали, что число флуоресцирующих MDCK клеток на лунку было прямо пропорционально увеличению PR8 вирусные титры. Несмотря на то, оптическую эффективность аргонового лазера на основе флуорохромом возбуждения обеспечивает яркое изображение сотовый, его узкий сигнал-шум и флуоресценции клеток оказывают вирусные количественных крайне сложно, особенно на нижних титрования. Поэтому, чтобы установить точную вирусный метод оценки мы использовали ИК на основе красителя обнаружения и количественного системы. MDCK клеток (10 4 / а) культивировали в 96-луночных планшетах, инфицированных PR8 и вирусные белки были обнаружены с помощью анти-М2 следует ИК красителях сопряженных вторичными антителами. Использование анти-М2 антител позволило нам использовать антиген-специфической интенсивности флуоресценции как прямое метрическое вирусных количестве. Чтобы перечислить интенсивности флуоресценции, мы использовали LI-COR Одиссея на основе ИК-сканера. Эта система использует два канала лазерной барельефыред ИК-датчиков для определения флуорофоров и отличить их от фоновых шумов. Первый канал возбуждается при 680 нм и излучает при 700 нм, чтобы помочь количественного фона. Второй канал обнаруживает флуорофоров, которые возбуждают при 780 нм и излучает на длине волны 800 нм. Сканирование PR8-инфицированных клеток MDCK в LI-COR Odyssey указано вирусный титр зависят от яркой флуоресценции (рис. 1б). М2 положительный люминесцентные MDCK клетках были отчетливо видны внутри скважины (рис. 1б). Положительная корреляция интенсивности флуоресценции для титра вируса, начиная с 10 2 -10 5 PFU может быть постоянно наблюдается. PR8 вирусного титрования выше 10 6 БОЕ приводят к гибели клеток, который устанавливает верхний предел чувствительности анализа. Минимальный, но обнаружить положительных постоянно видели с 10 2 -10 3 PFU PR8 вирусные титры показали высокую чувствительность ближней ИК-красителей. Отношение сигнал-шум определяется путем сравнения MOCк-инфицированных или изотипа антител обработанных MDCK клеток. Оба этих элементов привело к незначительным или неопределяемых уровней флуоресценции (рис. 1б). Для дальнейшего повышения чувствительности и снижения требований к испытаниям объем образца, мы заражены 5 × 10 3 MDCK клеток / лунку в 384-луночных планшетах. Различные Pfus из PR8 были протестированы как серийные разведения одного журнала (рис. 1в). Определение чувствительности от 384-луночных был сопоставим с 96-и анализы пластины. И 10 1 и 10 2 PFU последовательно работали лучше в 384-луночных по сравнению с 96-луночных планшетах. Использование интенсивности флуоресценции с 96 – или 384-и форматов плиты, были построены стандартные кривые титрования (рис. 1D). В этих расчетах, первая переменная вирусный титр а второй переменной интенсивности флуоресценции. Таким образом, мы использовали экспоненциальное распределение для создания кривой нужным determНИС многочлен отношения между вирусные титры и интенсивности флуоресценции. Мы также подтвердили наши наблюдения с помощью другого антитела, которые направлены против нуклеопротеидов (NP) по PR8 вирус (данные не представлены). Различные источники PR8 штаммов были также использованы для заражения MDCK клеток, которые были протестированы с анти-NP или анти-М2 антител (данные не представлены). Вместе, мы заключаем, что ИК на основе красителя белка система обнаружения может помочь диагностировать заражение вирусными штаммами и точно перечислять титр заражения патогенами. Математические соображения для расчета вирусные титры Математические расчеты интенсивности флуоресценции и определения титра сделали, как описано ниже. После окрашивания процедуры, целую тарелку или отдельных скважин в пластине количественно, используя LI-COR Odyssey программного обеспечения. Использование автоматического инструмент Shape, границы целевой области (ROI) был разработан в середине разведочных скважин 96 – или 384-мыLL пластин (рис. 2А и В). Создание ROI позволяет программное обеспечение для сравнения определены скважин фоне вируса титровать образцов. ROI фон был использован для установки базовых значение для всего анализа. Два противоположных перекрестие (белые) были введены в ROI для измерения интенсивности флуоресценции по так (рис. 2). Кривые на правой стороне и ниже представитель скважин на рисунке 2C представляют интенсивности точек в этих перекрестие. Люминесцентные интенсивности при равномерном интервалы ROI были измерены и набранные баллы данные были интегрированы. Стандартный множитель отклонения определяются уровнем сигнала в базовой, которая была включена в определении ROI. Фон флуоресценции количественно от макета-инфицированных или вторичными антителами только контроль и использовать для оценки интегральной интенсивности в тестовой скважины. Мы выбрали интегральной интенсивности для расчетов, потому что represродители чистый объем пикселей на определенный индивидуальный месте и не зависит от размера элемента. Кроме того, интегральная интенсивность существенно зависит от разрешения. Общая интенсивность / пиксел (I) соответствует интенсивности сигнала, связанные с выбранным хорошо площади пикселя (ли), а также сигналов, возникающих на фоне площади пикселя (б). Таким образом, для пикселя 'я': Я я = я с я + я б Pixel объем представляет собой как величина сигнала и области, в которой он распространяется. Сигнал области, связанные с распределением пример, который генерирует сигнал. Пиксель объем равен суммарный сигнал измеряется в пикселях "я" в этом районе (а) пикселей раз его высота (I). Таким образом, для пикселя 'я': VI = я я Общий объем пиксель суммирования общий сигнал от всей площади следующим образом: ; п. п. V = Σv я = aΣI я = 1 = 1 Интегральная интенсивность равна сумме значений интенсивности всех пикселей заключены функции, умноженной на площадь круга / прямоугольника (кол-мм 2). Таким образом, интегральная интенсивность = (£ ^ я – б) Здесь б обозначает среднюю интенсивность пикселя фона. Эта формула вычисляет интегральной интенсивности сигнала управления или экспериментальных скважин и тем самым устанавливает стандартную кривую. Вирусные титры в исследуемых образцах были рассчитаны с использованием стандартной кривой. Концентрация (интенсивность) определяется как количество флуоресценции присутствует в определенной рентабельности. Концентрации в тесте образцы расчетовТед по отношению к определенной концентрации стандартов в тот же образ. Чтобы вычислить точный вирусные титры, интенсивность каждой концентрации стандарта построены и оснащены длинной кривой интерполяции. Концентрации образцов рассчитывается путем сравнения интенсивности области в рамках стандартной кривой. Определение вирусных титров из БАЛ гриппа инфицированных мышей Обнаружение живых вирусных частиц гриппа в клинических и лабораторных образцов имеет решающее значение. Таким образом, мы рассмотрели следующий можем ли мы использовать этот метод для определения вирусных титров в лабораторных образцов. BAL жидкости собирали из неиммунизированных мышей и шипами с известным количеством PR8 вируса. Spiked BAL жидкости были линейно титровать для перечисления вирусные титры. Аликвоты шипами BAL жидкости были использованы для заражения клеток MDCK в 96-луночных планшетах, фиксировали и окрашивали анти-M2 и ИК красителях сопряженных secondarу антител. Результаты показаны на рисунке 3А показывают, что вирусные титры в шипами БАЛ были обнаружены и коррелирует с PR8 титры в стандартной кривой. Используя стандартную кривую, точные цифры в вирусной шипами и титровать БАЛ была определена. Экспоненциальная расчетов кривую при условии мер для расчета вирусные титры в шипами БАЛ (рис. 3В). С помощью этого метода мы получили отличную корреляцию между расчетными и шипами вирусные титры, проверка этого подхода (рис. 3). Далее мы проанализировали БАЛ от PR8-инфицированных мышей. PR8 широко применяется в мышиной модели, чтобы понять патологии человека и анти-вирусные иммунитет 3. Группы мышей интраназально инфицированных с 5000 PFU из PR8. Мышей наблюдали за потерю веса, появление сутулой спиной, взъерошенная шерсть и другие клинические симптомы. В те дни, 0, 2, 4, 7 и 10 после заражения,мышей забивали и BAL жидкости были собраны. Для использования этих лабораторных образцов, MDCK клеток инкубировали с серийных разведений БАЛ в конечном объеме 50 мкл в течение 17 ч в 96-луночных планшетах. Управление скважин MDCK клеток, зараженных известными титрами акции PR8 вируса служит для создания калибровочной кривой. После заражения клетки отмывали, фиксировали и окрашивали анти-М2 первичных антител следует ближней ИК красителях сопряженных вторичными антителами. MDCK клеток, которые были инфицированы макет или обработанные изотипа контроля после заражения послужили основой интенсивности флуоресценции для титр расчетов. Анализ БАЛ показал, что PR8 вирус в лабораторных условиях образец обнаруживается через ИК на основе красителя анализа системы. Значительное увеличение вирусной нагрузки в БАЛ было отмечено в дни 2 и 4 после заражения (рис. 4а). Расчет интегральной интенсивности указано, что БАЛ жидкости из дней 2 и 4 сообщения яnfection содержащиеся значительное количество PR8 вируса (рис. 4В). Наши результаты показывают, постепенное, но значительное снижение веса на протяжении ранней стадии PR8 инфекции, что свидетельствует о тяжести заболевания. Тем не менее, большинство мышей начала оправляться от симптомов заболевания и набирает вес 7 дней после заражения (рис. 4С). Мыши на 10-й день после заражения не было заметного PR8 указанием оформление вируса, которая также связана с увеличением массы тела и значительное сокращение симптомов заболевания. Чтобы еще больше расширить сферу применения этого теста, мы протестировали в 2009 году (H1N1), гриппа человека изолировать с ИК на основе красителя система обнаружения антител и сравнил его с в режиме реального времени ПЦР. Этот клинический пример был выделен из носоглотки комбинированной / мазок из зева получены от подозреваемого больного. Изолировать распространялся в MDCK клеточной линии в Милуоки Департамента здравоохранения лаборатории. Результаты испытаний были комкрасный для проверки чувствительности ИК на основе красителя методом ПЦР в реальном времени анализа (рис. 5). Полученные результаты свидетельствуют о том, что ИК на основе красителя антител система имеет потенциал, чтобы обнаружить вирусную нагрузку столь же низко как 10 3 TCID 50 / мл, что сопоставимо с ПЦР-анализа (10 TCID 50 / мл) и входят в клиническую значимость диапазон для большинства образцов. Эти результаты дают убедительные доказательства того, что ИК на основе красителя анализа система имеет достаточную чувствительность и потенциал, чтобы быть применен для перечисления вирусных титров в лабораторных исследований и клинических условиях. Рисунок 1. ИК на основе красителя иммунной обнаружения вируса гриппа. (A) конфокальный микроскопический анализ грипп-инфицированных клеток MDCK в 8-и слайды камеры. Иммунофлуоресценции микроскопический анализы демонстрируют сторонник MDCK монослоя во многом остается нетронутой и загружается с вирусами производных M2 белка. (BC) Количественная оценка вирусные титры на основе красителя и ИК-LI-COR Odyssey системы. (D) генерация стандартных кривых и экспоненциальная кривая согласия профилей. Данные, представленные в AD являются представителями пяти независимых экспериментов. Рисунок 2. Методология определения вирусных титров использованием ИК-красителей. (A) Комплексная флуоресцентных измерений интенсивности. Определенный участок в разведочных скважин (ROI) был отмечен для измерения интенсивности флуоресценции. Используя инструмент Auto Форма, границы рентабельности были сделаны в середине испытание скважин 96 – или 384-луночных планшетах. Флуоресценции измеряли в виде отдельных точек (пикселей = п) в пределах рентабельности. Интегральная интенсивность равна сумме значений интенсивности всех пикселей заключены функции, умноженной на площадь круга / прямоугольника (кол-мм 2). (B) Определение комплексной интенсивности флуоресценции в анализе скважин. Создание ROIпозволило LI-COR сканер для сравнения определены скважин фоне вируса титровать образцов. Фон флуоресценции количественно от макета-инфицированных или вторичными антителами только контроль и использовать для оценки интегральной интенсивности в тестовой скважины. (C) Сбор данных пунктов в пределах рентабельности. Два противоположных перекрестие (белые) были введены в ROI для измерения интенсивности флуоресценции через скважины. Кривые на правой стороне и ниже представитель скважины представляют собой интенсивности точек в этих перекрестие. Рисунок 3. Обнаружение и количественное определение вируса титры в PR8 шипами BAL жидкости. (A) MDCK клетки культивировали в 96-луночных планшетах в ночное время и добавил с шипами PR8-БАЛ. Плиты были зачитаны в LI-COR Odyssey системы. (B) экзогенно шипами БАЛ была по сравнению со стандартными кривыми. (C) Сравнение расчетных ожидаемых вир Аль-титры. Экспоненциальная кривая установка при условии у = 9.4784e 0.0014x. Данные, представленные в переменного тока являются представителями трех независимых экспериментов. Рисунок 4. Обнаружение и количественное определение вируса гриппа в BAL жидкости из PR8 инфицированных мышей. (А) группы мышей интраназально инфицированных с 5000 PFU из PR8. MDCK клеток инкубировали с серийных разведений БАЛ в конечном объеме 50 мкл в течение 17 ч в 96-луночных планшетах. После заражения клетки отмывали, фиксировали и окрашивали анти-М2 первичных антител следует ИК красителях сопряженных вторичными антителами. Правая панель представляет стандартной кривой. (B) Количественная оценка вирусные титры в БАЛ зараженных мышей. (C) Потеря веса мышей в течение PR8 инфекции коррелирует с вирусной нагрузкой. Данные, представленные в переменного тока являются представителями трех независимых экспериментов. повторное 5 "SRC =" / files/ftp_upload/3623/3623fig5.jpg "/> Рисунок 5. Обнаружение и количественное 2009 года (H1N1) (ДПМ) гриппа изолировать от больного человека. (A), ИК на основе красителя флуоресценции антител Система обнаружения половиной раза титрования инфицированных MDCK клеточной линии. Флуоресценции результаты указывают на анализе есть потенциал, чтобы обнаружить вирусную нагрузку столь же низко как 10 3 TCID 50 / мл. (B) нуклеиновой кислоты, извлеченные из культуры изолировать вместе с серийным десятикратном разведении известной оттитрованы H1N1 изолировать были проанализированы с CDC в режиме реального времени ПЦР 12. Предел обнаружения для ПЦР в реальном времени было 10 TCID 50 / мл.