High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell'influenza

1. MDCK cellule cultura Cultura 5 milioni di cellule MDCK pernottamento in centimetri-75 T 2 pallone in 20 ml di RPMI1640 mezzo completo con 10% FBS, 100 U / ml di penicillina, 100 pg / ml streptomicina, 1 piruvato sodio mM, 5% di bicarbonato di sodio 7,5% soluzione e 0,001% β-mercaptoetanolo in uno 37 ° C incubatore infuso con 5,2% CO 2. 2. PR8 infezione e la raccolta di liquido BAL Sfida C57BL / 6 topi intranasale con 5.000 PFU di PR8 virus in sterile PBS in un volume totale di 30 pl attraverso una narice. Effettuare infezioni finte usando solo PBS sterile senza il virus. Euthanize topi 0, 2, 4 e 7 giorni dopo l'infezione e tagliare la cavità toracica aprire e fare un 1 parallela incisione centimetro alla trachea attraverso la pelliccia del mouse per esporla. Effettuare una incisione mediana sulla aspetto prossimale della trachea. Infondi la trachea con 0,5 ml di PBS-1% BSA e aspirare il BAL fluido. Fluidi BAL possono essere memorizzati in congelatore a -20 ° C fino utilizzato. 3. Infezione da virus e l'individuazione di proteine ​​della matrice virale (M2) con la LI-COR Odyssey Per quantificare i titoli virali che utilizzano raggi infrarossi dye-anticorpi coniugati, raccogliere le cellule MDCK da T-75 cm 2 palloni e la piastra in fondo nero ottica piatto a 96 pozzetti (10.000 cellule per pozzetto) o 384 (oltre 5.000 cellule per pozzetto ) piatti. Cultura le cellule MDCK per notte a 37 ° C in RPMI1640 mezzo completo e lavare due volte con serum-free DMEM contenente BSA (0,2%, peso / volume), penicillina (100 U / ml), streptomicina (100 pg / ml), sodio piruvato (1 mM), soluzione di sodio bicarbonato (5% del 7,5%) e β-mercaptoetanolo (0,001%). Incubare le cellule MDCK con fluido BAL (50 microlitri per 96-well piastra o 10 microlitri per piastra a 384 pozzetti) o PR8 virus con titoli noti in ciascun pozzetto con volume uguale (50 microlitri per 96-well piastra o 10 microlitri per 384 – ben piastra) di medium DMEM,contenente L-1-tosylamido-2-feniletile chetone clorometil (TPCK)-trattata tripsina (0,2 pg / ml). Dopo 1 h di infezione, aggiungere 100 microlitri (piastra a 96 pozzetti) o 20 pl (piastra a 384 pozzetti) del 10% FBS-contenente RPMI1640 mezzo completo a ciascun bene. Continuare coltivazione di cellule MDCK per un'altra h 16 di infezione; lavare le cellule MDCK due volte con 100 pl (piastra a 96 pozzetti) o 20 pl (piastra a 384 pozzetti) di PBS-1 soluzione BSA% e fissare con 100 pl (96-bene piastra) o 20 pl (piastra a 384 pozzetti) del 1% paraformaldeide per 5 min. Seguendo fissaggio, incubare le cellule MDCK ulteriormente per 30 min con 100 pl (piastra a 96 pozzetti) o 20 pl (piastra a 384 pozzetti) di PBS-1% BSA per il blocco. Dopo il bloccaggio incubare le cellule MDCK per per 1 h con anticorpo primario contro la proteina M2 (1:1000, diluito in PBS-1% BSA). Utilizzare 50 microlitri per pl bene e 20 di anticorpo diluito, per pozzetto in 96-ben o 384-bene piastre, rispettivamente. Lavare le cellule MDCK tre volte con 100 pl (piastra a 96 pozzetti) O 20 pl (piastra a 384 pozzetti) di PBS-contenente 1% BSA e incubare per 1 h con 50 microlitri (piastra a 96 pozzetti) o 20 pl (piastra a 384 pozzetti) capra anti-topo IRDye @ 800 anticorpo secondario ( 1:200 diluizione). Lavare le cellule MDCK tre volte con 100 pl di PBS-contenente BSA 1%. Posizionare le piastre colorate sulla piattaforma lettura di vetro dello scanner Odyssey LI-COR IR e impostare il lettore per un 96 – o la lettura piastra a 384 pozzetti. Blank pozzetti di controllo negativi può essere impostato utilizzando il LI-COR software Odyssey. Quantificare intera piastra o pozzetti selezionati all'interno di lastra, con LI-COR software Odyssey. Utilizzando lo strumento forma automatica, disegnare i confini di una regione bersaglio (ROI) nel bel mezzo di un pozzetto di 96 – o 384 pozzetti. Creazione di ROI permette al software di confrontare i pozzi di fondo definite ai campioni di virus titolati. Per impostare il valore di base per il dosaggio intero, utilizzare un ROI sfondo. Introdurre i due mirino opposti forniti dal software Odyssey entro il ROI di misure l'intensità della fluorescenza attraverso il bene. Scansione piastre con canale 780 nm per il rilevamento e 680 nm come lunghezza di riferimento in uno scanner Odyssey LI-COR IR. Una volta che il comando 'Read' è attivata, le intensità di fluorescenza a intervalli uniformi del ROI saranno misurati ei dati raccolti punti integrati. Un moltiplicatore deviazione standard determinerà il livello del segnale sul baseline che è incluso nella determinazione ROI. Fluorescenza Background verranno quantificati dal anticorpo mock-infetto o secondaria da solo controlla e saranno utilizzati per stimare la intensità integrata in pozzetti test. Ha scelto 'intensità integrata' per i calcoli, perché rappresenta il volume netto pixel per un posto definito individuo ed è indipendente dalla dimensione del tratto. Utilizzare la curva standard dei titoli virali conosciuti per il calcolo dei titoli virali di campioni sconosciuti. Utilizzare una lunga curva di interpolazione per calcolare con precisione i titoli virali. Calcolare la vtitoli iral nei campioni prova da parte confrontando le intensità dei campioni di prova con la curva standard. 4. Risultati rappresentativi Standardizzazione delle IR dye-based ad alta velocità sistema di rilevamento virale PR8 virus possono infettare le cellule MDCK, quindi, abbiamo usato queste cellule per sviluppare questo test. Abbiamo misurato i titoli virali utilizzando un anticorpo primario contro una proteina virale matrice influenza (M2). A differenza di altre metodologie, abbiamo usato un anticorpo secondario che è coniugato ad un vicino-IR colorante. Questo metodo fornisce un modo semplice, automatico PR8 determinazione del titolo virus mediante l'intensità di fluorescenza che viene generato durante il rilevamento proteina M2. Dopo l'infezione influenzale virus, proteina M2 è tradotta, trasportato e accumula nella cellula ospite compresa la superficie cellulare. Così, la quantità della proteina M2 rappresenta un parametro misurabile per determinare la quantità del virus. Confrontando le intensità dii campioni di prova con la curva standard fornisce la misurazione precisa di titoli virali. Per determinare l'efficacia del fluorescenza-based metodo, abbiamo coltivate 10 4 cellule MDCK / bene in camera scorre durante la notte. PR8 stock virali di titoli noti sono stati aggiunti per duplicare pozzetti con unità placca diverse formanti (PFU) e consentito di adsorbire sulle cellule per un'ora. Le cellule sono state incubate per 16 h per consentire il virus per propagarsi. Dopo questo, le cellule MDCK nelle diapositive camera sono stati fissati con 1% paraformaldeide, lavato e colorate con anticorpi anti-M2 anticorpo per 1 h, seguito da AlexaFluor 488-coniugato anticorpo secondario per un ulteriore 1 h. Confocali analisi microscopiche di infettate cellule MDCK dimostrato il monostrato aderente era in gran parte intatta e la PR8-derivata proteina M2 era abbondantemente presente all'interno delle cellule infettate MDCK (Figura 1A). Cellule fluorescenti potrebbe essere rilevato in infezioni con titoli virali basso quanto 10 2 </sup>. Queste analisi anche rivelato che il numero di cellule fluorescenti MDCK per pozzetto erano direttamente proporzionali ai crescenti PR8 titoli virali. Anche se, l'efficienza ottica di argon laser-based di eccitazione fluorocromo offre immagini nitide cellulari, il suo stretto rapporto segnale rumore e l'autofluorescenza delle cellule virali quantificazioni rendono estremamente difficili, soprattutto a basse titolazioni. Pertanto, per stabilire un metodo preciso di stima virale abbiamo impiegato un IR dye-based sistema di rilevamento e la quantificazione. Cellule MDCK (10 4 / pozzetto) sono state coltivate in piastre a 96 pozzetti, infettati con PR8 e proteine ​​virali sono stati rilevati utilizzando anti-M2 seguita da uno IR colorante-coniugato anticorpo secondario. L'uso di anti-M2 anticorpo ci ha permesso di utilizzare l'antigene-specifica intensità di fluorescenza come una metrica diretta di quantità virale. Per enumerare l'intensità di fluorescenza, abbiamo usato il LI-COR Odyssey scanner basato su IR. Questo sistema utilizza due canali laser-basEd rilevamenti IR per identificare fluorofori e differenziarli dal rumore di fondo. Il primo canale eccita a 680 nm ed emette a 700 nm per contribuire a quantificare lo sfondo. Il secondo canale rileva fluorofori che eccitano a 780 nm ed emette a 800 nm. Scansione delle cellule MDCK PR8-infetti in LI-COR Odyssey indicato un titolo virale-dipendente fluorescenza (Figura 1B). M2 positive cellule fluorescenti MDCK erano chiaramente visibili all'interno della pozzetti (Figura 1B). Una correlazione positiva di intensità di fluorescenza a titolo virale a partire dal 10 2 -10 5 PFU potrebbe essere costantemente osservati. PR8 titolazioni virali superiore a 10 6 piombo PFU alla morte delle cellule, che fissa un limite superiore per la sensibilità del test. Positività Minimal ma rilevabile sempre visto con 10 2 -10 3 PFU PR8 titoli virali dimostrato l'elevata sensibilità delle near-IR coloranti. Il rapporto segnale-rumore è stata determinata confrontando la mock-infettato o isotipici cellule MDCK anticorpo-trattati. Entrambi questi controlli portato in livelli trascurabili o non rilevabili di fluorescenza (figura 1B). Per migliorare ulteriormente la sensibilità e di ridurre i requisiti del campione volume di prova, abbiamo infettato 5 × 10 3 cellule MDCK / ben in piastre a 384 pozzetti. PFUs Differenti di PR8 sono state testate come seriali uno diluizioni log (Figura 1C). Sensibilità Detection da piastre 384-pure era paragonabile a quella dei 96-pure saggi piastra. Sia 10 1 e 10 2 PFU operato con costanza meglio nelle piastre 384-bene rispetto a 96-pozzetti. Utilizzando le intensità di fluorescenza da 96 – o formati piastra da 384 pozzetti, abbiamo costruito curve di titolazione standard (Figura 1D). In questi calcoli, la prima variabile è il titolo virale mentre la seconda variabile è l'intensità di fluorescenza. Pertanto, abbiamo usato la distribuzione esponenziale per generare una curva-adatta a Determnare il rapporto polinomio tra i titoli virali e intensità fluorescenza. Abbiamo anche convalidato nostre osservazioni utilizzando un altro anticorpo che è diretto contro il nucleoproteina (NP) di PR8 virus (dati non mostrati). Fonti Distinct di PR8 ceppi sono stati utilizzati anche per infettare cellule MDCK che sono stati testati con anti-NP o anti-M2 anticorpi (dati non mostrati). Collettivamente, possiamo concludere che IR dye-based sistema di rilevazione delle proteine ​​può aiutare a diagnosticare infettare i ceppi virali e precisamente enumerare il titolo degli agenti patogeni infettanti. Considerazioni matematiche per il calcolo dei titoli virali I calcoli matematici di intensità di fluorescenza e determinazioni dei titoli anticorpali sono fatto come descritto di seguito. A seguito della procedura di colorazione, la piastra tutto o pozzetti selezionati all'interno di piastra sono quantificati con l'aiuto LI-COR software Odyssey. Utilizzo Strumento Auto Shape, frontiere di una regione bersaglio (ROI) è stata disegnata nel mezzo dei pozzetti di prova di 96 – o 384-noipiastre LL (Figura 2A e B). Creazione di ROI permette al software di confrontare i pozzi di fondo definite ai campioni di virus titolati. Un ROI sfondo è stato utilizzato per impostare il valore basale per il dosaggio intero. Due peli opposte croce (bianco) state presentate entro il ROI per misurare l'intensità della fluorescenza attraverso il ben (Figura 2C). Curve verso il lato destro e sotto i pozzi rappresentativi in Figura 2C rappresentare l'intensità dei pixel lungo questi peli croce. Le intensità di fluorescenza a intervalli uniformi del ROI sono stati misurati ed i punti dati raccolti sono stati integrati. Un moltiplicatore deviazione standard determinato il livello del segnale sopra la baseline che è stato incluso nella determinazione ROI. Background fluorescenza è stata quantificata dalla anticorpo mock-infetto o secondaria soli controlli e utilizzato per stimare la intensità integrata in pozzetti test. Abbiamo scelto intensità integrata per calcoli perché esso rapprevolume di pixel genitori netto per un singolo punto definito ed è indipendente dalla dimensione del tratto. Inoltre, intensità integrata è sostanzialmente indipendente di risoluzione. Intensità Total / pixel (I) corrisponde all'intensità del segnale derivante dalla selezionato bene nella zona pixel (Is) più il segnale derivante dallo sfondo dell'area di pixel (b). Pertanto, per pixel 'i': I i = I + s i b i Volume di Pixel rappresenta sia la grandezza del segnale e la zona in cui è distribuita. Zona Signal è collegata alla distribuzione di campione che sta generando il segnale. Il volume pixel è uguale al segnale totale misurato in pixel 'i' nella zona (a) del pixel volte la sua altezza (I). Così, per pixel 'i': vi = a I i Volume di pixel totale è la somma del segnale totale di tutta l'area in questo modo: ; n n V = Σv i = aΣI i i = 1 i = 1 Intensità integrata è la somma dei valori di intensità di tutti i pixel racchiusi da funzionalità, moltiplicato per l'area del cerchio / rettangolo (count mm 2). Pertanto, l'intensità integrato = uno (ΣI i – b) Qui, b sta per l'intensità media pixel di sfondo. Questa formula calcola le intensità di segnale integrati del controllo o pozzetti sperimentali e stabilisce in tal modo una curva standard. Titoli virali nei campioni analizzati sono stati calcolati utilizzando questa curva standard. Concentrazione (di intensità) è definita come la quantità di presente fluorescenza in uno ROI definito. Le concentrazioni nei campioni di prova sono i calcoliTed relativi alle concentrazioni definite delle norme nella stessa immagine. Per calcolare i titoli precisi virali, l'intensità di ciascuna norma di concentrazione è tracciata e dotato di una curva interpolazione lunga. Le concentrazioni dei campioni test sono calcolati confrontando l'intensità della area all'interno della curva standard. Determinazione di titoli virali da fluido BAL di topi influenzali infetti Rilevamento di particelle virali influenzali in diretta in campioni clinici e di laboratorio è di importanza critica. Pertanto, abbiamo prossima esaminato se possiamo utilizzare questo metodo per determinare i titoli virali in campioni di laboratorio. Fluidi BAL sono stati raccolti dai topi non immunizzati ed è stata aggiunta una quantità nota di PR8 virus. Spiked fluidi BAL sono stati linearmente titolato per enumerare i titoli virali. Aliquote di chiodate fluidi BAL sono stati utilizzati per infettare cellule MDCK in piastre a 96 pozzetti, fissate e colorate con anti-M2 e IR dye-coniugato secondary anticorpi. I risultati mostrati in figura 3A dimostrare che i titoli virali nel fluido spiked BAL erano rilevabili e correlata con le PR8 titoli nella curva standard. Utilizzando la curva standard, i numeri precisi virali nel liquido arricchito e titolato BAL è stata quantificata. Esponenziali calcoli fit curva fornito una misura per calcolare le titoli virali nel liquido spiked BAL (Figura 3B). Con questo metodo abbiamo ottenuto ottimi correlazioni tra i titoli calcolati ed è stata aggiunta virali, convalidando questo approccio (Figura 3C). Successivamente, abbiamo analizzato il liquido BAL da PR8 topi infettati. PR8 è stato ampiamente utilizzato in modelli murini di comprendere umano 3 patologia e l'immunità anti-virale. Gruppi di topi sono stati infettati per via intranasale con 5.000 PFU di PR8. I topi sono stati monitorati per la perdita di peso, comparsa di gobba, pelliccia arruffata e altri sintomi clinici. Nei giorni 0, 2, 4, 7 e 10 di post-infezione,topi sono stati sacrificati e fluidi BAL sono stati raccolti. Per utilizzare questi campioni di laboratorio, cellule MDCK sono state incubate con diluizioni seriali di fluido BAL in un volume finale di 50 microlitri per 17 h in piastre da 96 pozzetti. I pozzetti di controllo MDCK di cellule infettate con titoli noti delle scorte PR8 virus è servito a generare una curva standard. Dopo l'infezione, le cellule sono state lavate, fissate e colorate con anti-M2 anticorpo primario seguita da vicino-IR dye-coniugato anticorpo secondario. Cellule MDCK che erano mock-infettati o trattati con controlli isotipici dopo l'infezione a condizione che le intensità di fluorescenza di fondo per i calcoli titolo. Analisi del liquido BAL ha dimostrato che PR8 virus nel campione laboratorio è rilevabile attraverso il dye-based sistema di analisi IR. Un aumento significativo del carico virale nel fluido BAL è stata osservata nei giorni 2 e 4 post infezione (Figura 4A). Calcoli di intensità integrata indicato che i fluidi di BAL giorni 2 e 4 i postnfection conteneva livelli significativi di PR8 virus (Figura 4B). I nostri risultati mostrano una perdita di peso graduale ma significativa durante la fase precoce di PR8 dell'infezione, dimostrando la gravità della malattia. Tuttavia, la maggior parte dei topi ha iniziato il recupero dai sintomi della malattia e aumento di peso sette giorni dopo l'infezione (Figura 4C). Mice nel giorno 10 dopo l'infezione mancava di qualsiasi PR8 rilevabile indicante la clearance del virus, che anche correlata con l'aumento in peso corporeo e riduzioni considerevoli dei sintomi della malattia. Per estendere ulteriormente l'applicazione di questo saggio, abbiamo testato un 2009 A (H1N1) dell'influenza umana isolare con IR dye-based sistema di anticorpo di rilevazione e lo ha confrontato con il real-time PCR. Il campione clinico è stato isolato da un tampone nasofaringeo combinato / gola ottenuto dal paziente sospetto. L'isolato è stato propagato nella linea cellulare MDCK presso il Dipartimento di Salute Milwaukee Laboratory. I risultati dei test sono stati comparosso per verificare la sensibilità del IR colorante-based metodo per real-time PCR (Figura 5). I risultati indicano che l'IR colorante-based sistema di rilevamento anticorpo ha il potenziale per rilevare carico virale basso quanto 10 3 TCID 50 / ml, che è paragonabile a PCR-saggio basato (10 TCID 50 / ml) e rientrano la rilevanza clinica range per la maggior parte dei campioni dei pazienti. Questi risultati forniscono una forte evidenza che l'IR dye-based sistema di analisi è sufficiente sensibilità e le potenzialità da applicare per il conteggio titolo virale in laboratorio di ricerca e cliniche. Figura 1. IR dye-based rilevazione immunitaria del virus dell'influenza. (A), analisi al microscopio confocale di influenza le cellule infettate dal MDCK a 8-diapositive e da camera. Immunofluorescenza analisi al microscopio dimostrare la monostrato aderente MDCK è in gran parte intatto e carico di virus di derivazione M2 proteina. (BC) Quantificazione dei titoli virali a base di colorante e IR LI-COR sistema Odyssey. (D) Generazione di curve standard e curve esponenziali-fit profili. I dati presentati in AD sono rappresentative di cinque esperimenti indipendenti. Figura 2. Metodologia di determinazione titoli virali che utilizzano coloranti IR. (A) misure integrate di intensità di fluorescenza. Una zona definita all'interno del pozzetti prova (ROI) è stato caratterizzato per misurare le intensità di fluorescenza. Utilizzando forma dell'utensile Auto, confini del ROI sono stati elaborati nel bel mezzo dei pozzi di prova di 96 – o 384 pozzetti. Fluorescenza è stata misurata come singoli pixel (pixel = n) all'interno del ROI. Intensità integrata è la somma dei valori di intensità di tutti i pixel racchiusi da funzionalità, moltiplicato per l'area del cerchio / rettangolo (count mm 2). (B) Determinazione delle intensità di fluorescenza integrati in pozzetti. Creazione di ROIpermesso di LI-COR scanner per confrontare i pozzi di fondo definite per i campioni di virus titolati. Background fluorescenza è stata quantificata dalla anticorpo mock-infetto o secondaria soli controlli e utilizzato per stimare la intensità integrata in pozzetti test. (C) Raccolta di punti dati all'interno del ROI. Due peli opposte croce (bianco) state presentate entro il ROI per misurare l'intensità della fluorescenza attraverso il bene. Curve verso il lato destro e sotto i pozzetti rappresentativi rappresentare l'intensità dei pixel lungo questi peli croce. Figura 3. Individuazione e quantificazione dei virus titoli in PR8 fluidi a spillo BAL. (A) MDCK cellule sono state coltivate in piastre da 96 pozzetti durante la notte e ha aggiunto con PR8-spillo BAL. Piastre sono state lette nel LI-COR sistema Odyssey. (B) esogena fluido a spillo BAL è stato confrontato con le curve standard. (C) Confronto tra calcolato vir previsto Al titoli. Montaggio di curva esponenziale prevista y = 9.4784e 0.0014x. I dati presentati in AC sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. Figura 4. Individuazione e quantificazione dei virus dell'influenza nei fluidi BAL PR8 da topi infetti. (A) gruppi di topi sono stati infettati per via intranasale con 5.000 PFU di PR8. Cellule MDCK sono state incubate con diluizioni seriali di fluido BAL in un volume finale di 50 microlitri per 17 h in piastre da 96 pozzetti. Dopo l'infezione, le cellule sono state lavate, fissate e colorate con anti-M2 anticorpo primario seguita da IR colorante-coniugato anticorpo secondario. Il pannello all'estrema destra rappresenta la curva standard. (B) Quantificazione dei titoli virali nel liquido BAL di topi infetti. (C) La perdita di peso dei topi durante il PR8 l'infezione correlata con il carico virale. I dati presentati in AC sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. sull'articolo 5, "src =" / files/ftp_upload/3623/3623fig5.jpg "/> Figura 5. Individuazione e quantificazione del 2009 A (H1N1) (pdm) L'influenza isolato da un paziente umano. (A) L'IR dye-based sistema di rilevamento degli anticorpi a fluorescenza per piegare a metà titolazione della linea cellulare infetta MDCK. I risultati fluorescenza indicano che il campione ha il potenziale per rilevare carico virale basso quanto 10 3 TCID 50 / ml. (B) L'acido nucleico estratto dalla cultura isolare con seriali dieci diluizioni di un noto H1N1 isolato titolati sono stati analizzati con il test real-time PCR CDC 12. Il limite di rilevazione per real-time PCR era di 10 TCID 50 / ml.