الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا
Summary
هذه الطريقة يصف استخدام الأشعة تحت الحمراء صبغ نظام التصوير القائم للكشف عن فيروس H1N1 في السائل قصيبية (بال) غسل من الفئران المصابة في حساسية عالية. لا يمكن أن يؤديها هذه المنهجية في 96 – أو 384 لوحة جيدا، يتطلب <10 ميكرولتر من حجم المواد واختبار لديه القدرة على فحص متزامن من مسببات الأمراض متعددة.
Abstract
فيروس الانفلونزا هي العوامل المسببة للأمراض في الجهاز التنفسي الذي يسبب درجة عالية من كل عام معدلات الاعتلال والوفيات في مناطق متعددة من العالم. لذلك فإن التشخيص الدقيق للاصابة بسلالة وفحص سريع عالية الإنتاجية من أعداد هائلة من العينات السريرية أمر بالغ الأهمية للسيطرة على انتشار الأمراض الوبائية. وتستند التشخيصات السريرية الحالية من عدوى الإنفلونزا على اختبار مصل الدم، بوليميريز سلسلة من ردود الفعل، مباشرة المناعي العينات وخلية 1،2 الثقافة.
هنا، ونحن التقرير تطور تقنية جديدة للتشخيص المستخدمة للكشف عن فيروسات الأنفلونزا الحية. استخدمنا الإنسان الفأر تتكيف A/PR/8/34 (PR8، H1N1) فيروس 3 لاختبار فعالية هذه التقنية باستخدام الخلايا MDCK 4. تم زراعة الخلايا MDCK (10 4 أو 5 × 10 3 لكل بئر) في 96 – أو تم الكشف عن 384 لوحات جيدة، مصابة PR8 والبروتينات الفيروسية استخدام الألغام المضادة للM2 تليها ثانية صبغ مترافق IRondary الأجسام المضادة. M2 (5) وراصة دموية 1 هي علامة اثنين من البروتينات الرئيسية المستخدمة في فحوصات التشخيص كثير مختلفة. التقليل من توظيف IR-صبغ مترافق الأجسام المضادة الثانوية تألق ذاتي المرتبطة الأصباغ الفلورية الأخرى. يسمح للاستخدام الألغام المضادة للأجسام المضادة M2 لنا لاستخدام كثافة مستضد محدد مضان باعتباره متري مباشرة من كمية الفيروس. تعداد كثافة مضان، استخدمنا LI-COR الماسحة الضوئية الحمراء أوديسي مقرها. هذا النظام يستخدم اثنين من قناة الليزر القائمة على اكتشافات الأشعة تحت الحمراء لتحديد fluorophores وتمييزها من الضوضاء في الخلفية. القناة الأولى يثير في 680 نانومتر، وتنبعث عند 700 نانومتر للمساعدة في تحديد الخلفية. القناة الثانية بالكشف عن fluorophores التي تثير في 780 نانومتر، وتنبعث منها في 800 نانومتر. وأشار المسح الضوئي للPR8 الخلايا المصابة MDCK في الماسحة الضوئية الحمراء فيروسية عيار التي تعتمد على مضان مشرق. ويمكن لعلاقة إيجابية من كثافة مضان لعيار الفيروس بدءا من 10 2 5 -10 PFU يكون يخدعولاحظ sistently. الحد الأدنى من الإيجابية ولكن يمكن اكتشافها ينظر باستمرار مع 10 2 -10 3 PFU PR8 التتر الفيروسية أظهرت حساسية عالية من الأصباغ القريب من الأشعة تحت الحمراء. تم تحديد نسبة الإشارة إلى الضوضاء من خلال مقارنة وهمية المصابة أو isotype الأجسام المضادة الخلايا المعالجة MDCK.
استخدام كثافات مضان من 96 – أو صيغ لوحة 384 بشكل جيد، وضعنا منحنيات المعايرة القياسية. في هذه الحسابات، المتغير الأول هو عيار الفيروس في حين أن المتغير الثاني هو كثافة مضان. لذا، كنا التوزيع الأسي لإنشاء منحنى مناسبا لتحديد العلاقة متعدد الحدود بين التتر الفيروسية وكثافة مضان. بشكل جماعي، فإننا نستنتج أن الأشعة تحت الحمراء كشف عن البروتين صبغ النظام القائم يمكن أن تساعد في تشخيص اصابة السلالات الفيروسية وتعداد بالضبط عيار من مسببات العدوى.
Protocol
Discussion
اندلاع وباء انفلونزا الطيور مؤخرا في جنوب شرق آسيا والخوف العالمي من وباء انفلونزا الخنازير فرض مخاوف هائلة على الصحة والسلامة العامة. فقد تم تخصيص التركيز الحاسمة في توليد لقاحات للسلالات الحالية والجديدة من فيروس الانفلونزا. وسوف توفر تقنيات عالية الإنتاجية سريع للكشف عن حسابات دقيقة ودقيقة عيار الفيروسية تحسن بشكل هائل العلاج. التقنيات الأكثر شيوعا المستخدمة لحساب عيار فيروس تشمل فحوصات لوحة التراص تشكيل والأنفلونزا. وقد وضعت لأول مرة فحص لوحة تشكيل لتقدير التتر عاثية واعتمد من قبل Dulbecco ريناتو لحساب التتر فيروسي حيواني 4. لإجراء هذا الاختبار، يتم إعداد بمقدار 10 أضعاف التخفيفات من الأوراق المالية أو إنفلونزا عينات حيوانية مثل السائل BAL ويتم تلقيح 0،1 aliquots مل على لأحادي الطبقة من الخلايا MDCK في 6 لوحات جيدة. ولا يسمح للفيروس إلى كثف على الخلايا MDCK يليه إعلانdition من وسيط المواد الغذائية والاغاروز. أثناء الحضانة، والخلايا الأصلية المصابة الافراج عن سلالة الفيروسية التي تنتشر فقط على الخلايا المجاورة. تأثير ممرض للخلايا من عدوى الانفلونزا الفيروسية وتنتج منطقة دائرية من الخلايا المصابة تسمى لوحة. يفترض أن يتم تشكيل كل لوحة بعد الإصابة من خلية واحدة مع جسيمات الفيروس واحدة تليها تكرار الفيروس. ويمكن تعزيز التباين بين الخلايا الحية واللوحات وبواسطة الأصباغ مثل البنفسجي وضوح الشمس. والعيب الرئيسي من هذا الفحص هو عدم وجود استنساخ والتغيرات الهائلة في التجارب. آخر فحص تستخدم لتحديد عيار الأنفلونزا الفيروسية هو مقايسة التراص. الحاضر راصة دموية بروتين على سطح فيروس الانفلونزا تربط بكفاءة للبروتينات التي تحتوي على حامض N-acetylneuraminic في الثدييات والطيور خلايا الدم الحمراء 1. هذا التفاعل بين فيروس الانفلونزا وكريات الدم الحمراء ويؤدي إلى تراص في شكل شعرية. لامويستخدم إيفل من تراص لتقدير عيار من فيروس الانفلونزا في عينات الاختبار. وتستخدم كريات الدم الحمراء مقايسة التراص فقط لتحديد المعايرة من فيروس يعرف، ولا يمكن أن تستخدم لأغراض تحديد سلالة. منذ هذا الاختبار لا يفرق بين الحي والميت للفيروسات، فإنه من الصعب الحصول على حساب دقيق من التتر الفيروسية.
وتستند التشخيصات السريرية الحالية من عدوى الإنفلونزا على اختبار مصل الدم، بوليميريز سلسلة من ردود الفعل، مباشرة المناعي عينة والثقافة الخلية 1،6. ووصف الطريقة الجديدة هنا أيضا إمكانية التشخيص السريري والمختبري. إنفلونزا كشف مجموعات Directigen الانفلونزا A. دينار بحريني (علوم الأحياء، سان خوسيه، كاليفورنيا) وBinaxNow (Binax، وشركة، سكاربورو، ME) استخدام فحص للكشف عن immunochromatography مستضد الفيروسية مثل البروتين النووي 7 ويمكن استخدام هذه المجموعات، والكشف عن فيروس يمكن تحقيقه في غضون 15 دقيقة، ولكن جميع العينات سلبية من الضروري أن تكون الصورة أيضاcreened من قبل خلية أسلوب ثقافة. وأفادت دراسات مختلفة أيضا انخفاض الحساسية لهذه المجموعات، وخصوصا، عندما العدوى كانت معتدلة أو منخفضة 8. في طريقة لنا، ونحن باستمرار اكتشاف ما يصل الى 100 PFU من الفيروس. وهذا يوحي لنا تقنية مفيدة في الكشف عن الفيروس H1N1 في العينات السريرية، حتى عندما تكون الإصابة خفيفة. وتم الإبلاغ عن طريقة مضان القائم على كشف المستضدات الفيروسية، حيث تم تحليل العينات إما بشكل مباشر أو نضح البلعوم تم تلقيح في الصعود إلى أحادي الطبقة من الخلايا عرضة لتكاثر الفيروس والتحليلات اللاحقة 9. ومع ذلك، وتقتصر هذه الطرق لأغراض التشخيص وغير مناسبة لإجراء العمليات الحسابية عيار الفيروس. Q-PCR يساعد على تحديد وجود الحمض النووي الريبي الفيروسي ولا تقدير العدوى من فيروسات حية. بالمقارنة مع هذه المقايسات، والأشعة تحت الحمراء نظام الفحص قائم على الأصباغ مساعدة في الكشف عن والفيروسية تعداد عيار في العينات السريرية والمخبرية. في حالة اندلاع الانفلونزا، فمنحاسم لتشخيص آلاف العينات في فترة زمنية قصيرة. يمكن أن أسلوبنا يستند على طبق من 384 جيدا، والماسحة الضوئية الحمراء تفحص 6 لوحات في وقت واحد (> 2000 عينة)، وتقدم بالتالي أكبر ميزة على أساليب أخرى فلوري مباشرة. يمكن أن الجدوى من سرعة معالجة الآلاف من العينات السريرية تقليل اختبار تقلباته، وطول الوقت وتكاليف الفحص. استخدام جسم مضاد M2 محددة توفر ميزة كونها مستقلة عن الخلافات السلالة في البروتينات H و N. يتم حفظها نسبيا من البروتين M2، في معظم سلالات الأنفلونزا تصيب البشر. إذا يتم الجمع بين الأضداد محددة لالبقع المنتشرة مع نظامنا لا يمكن للمرء قياس كل من عيار من الفيروسات والتعرف على السلالة. ومع ذلك، منذ M2 هو الهدف لهذه الأدوية مثل الأمانتادين، يمكن أن تنشأ المسوخ التي قد تغيير موقع ملزم لخريطة موقع المستخدمة هنا. وهذا يمثل الحد المحتملة لهذا النظام في الأفراد الذين يخضعون للعلاج بواسطة هذه العقاقير.
متعدديتم استخدام فحوصات تعداد التتر الأنفلونزا في عينات الاختبار. لحساب فيروس عيار، 50٪ جرعة زراعة الأنسجة المعدية (TCID 50) والبيض السقائي فحوصات السائل المستندة إلى وتستخدم على نطاق واسع 1،10. ومع ذلك، متطلبات عدة أيام جعل هذه الأساليب أقل موثوقية. علاوة على ذلك، في هذه الأساليب الحسابات على اساس تغير 50٪ في عدد من لوحات توفير المعايرة الفيروسية النظرية ولكن ليست دقيقة. لا يمكن أن يؤديها لوحة تشكيل المقايسات خلال 96 ساعة، ولكن عدم وجود استنساخ هو مصدر قلق كبير في العمليات الحسابية عيار الفيروسية. الأسلوب الحالي وصفها هنا له مزايا عدة متميزة. الأول، وهو أسلوب استنساخه للغاية مع نتائج متسقة. وتستند الثانية، وحسابات عيار الفيروسية في تقدير بسيط من كثافة مضان أن تتم مقارنة ضد منحنيات معيار محدد. الثالث، ويمكن استخدام اثنين أو أكثر من الأجسام المضادة الأولية لتشخيص الأنماط المصلية متعددة في نموذج معين. أيضا، IR صبغ مترافق الأجسام المضادة لها قطرةوقد استخدمت شركة تألق ذاتي والتصوير الخلية 11. الأشعة فوق البنفسجية أو الأشعة المرئية (300-600 نانومتر) النتائج في تألق ذاتي الخلوية مرتفعة بسبب وجود fluorophores ذات العوائد المرتفعة الكم الذاتية. وتشمل هذه الأحماض الأمينية العطرية ويبو أصباغ، النيوكليوتيدات pyridinic (NADPH)، الإيلاستين والكولاجين والإنزيمات المساعدة فلافين. هذه الخاصية الجوهرية للخلايا يجعل من الصعب الاستفادة من هذه المصادر من الإشعاع كما مجسات لقياس التعبير عن بروتينات معينة. في المقابل، القريب من الأشعة تحت الحمراء الأصباغ تثير وتطلق بين 670-1000 نانومتر. جزيئات المضيف العديد من الخلوية والهيدروكربونات العطرية المتعددة لا تثير في هذه الموجة، ونظرا لتشتت الضوء المنخفض، تنبعث منها منخفضة للغاية مضان الخلفية. علاوة على ذلك، وطرأ تحسن كبير على النافذة الخلفية وبين كشف محددة نتيجة لمعامل انقراض عالية من fluorophores القريب من الأشعة تحت الحمراء. صمود للضوء، متفوقة إشارة إلى نسبة الضوضاء، وثيق الصلة للغاية في تحديد مقدار التتر الفيروسية. استخدام microflوسوف الغرف uidic أتمتة عملية الفرز من خلال الضوابط الروبوتية، ويمكن أن تسمح لنا لاختبار عينات سريرية شديدة العدوى بسهولة. وهكذا، فإن استخدام الأشعة تحت الحمراء القريبة من الأصباغ في هذه الأساليب هو المثالي وموثوق بها للغاية لتعداد التتر فيروسية في عينات الأنسجة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل في شكل منح المعاهد الوطنية للصحة جزء R01 A1064826-01، U19 AI062627-01، NO1، HHSN26600500032C (لSM). ونحن نشكر أعضاء مختبرنا للحصول على مساعدة مناقشة والتقنية، وتينا هايل لمراجعة نقدية للمخطوطة. نود أن نشكر ديفيد بينا، وميلووكي مختبر وزارة الصحة للثقافة وفيروس PCR.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Bovine serum albumin | Atlanta Biologicals | S11750 | |
| PR8 virus | From Dr Thomas M Moran | ||
| Goat anti-mouse IRDye@800 | LI-COR biosciences | 926-32210 | 1:200 dilution |
| LI-COR Odyssey IR scanner | LI-COR-biosciences | 9201-01 | |
| 384-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 164730 | |
| 96-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 165305 | |
| DMEM medium | Invitrogen | 11965126 | |
| RPMI medium | Invitrogen | 11875135 | |
| Sodium bicarbonate | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamine 100x | Invitrogen | 25030 | |
| Trypson-EDTA | Invitrogen | R001100 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | |
| Anti-M-2 antibody | From Dr Thomas M Moran | ||
| Anti-NP mAb | CDC | V2S2208 | Obtained with an MTA |
References
- Hirst, G. K. The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus. Science. 94, 22-23 (1941).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units. Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).
- Kalter, S. S. Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus. Science. 110, 184-184 (1949).
- Dulbecco, R. Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).
- Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units. Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).
- Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).
- Landry, M. L., Ferguson, D. Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence. J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).
- Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA). J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).
- Doerr, A. Fluorescent proteins: into the infrared. Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).
- Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus. J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).
