Een Functionele Motor-eenheid in de cultuur Dish: Co-cultuur van het ruggenmerg Explantaten-en spiercellen
Summary
Gekweekte spiercellen een inadequate model om geïnnerveerde spier recapituleren<em> In vivo</em>. Een functionele aandrijving kan worden gereproduceerd<em> In vitro</em> Door innervatie van gedifferentieerde menselijke primaire spiercellen met behulp van ratten embryo ruggenmerg explantaten. Dit artikel beschrijft hoe co-culturen van het ruggenmerg explantaten en spiercellen zijn gevestigd.
Abstract
Menselijke primaire spiercellen aneurally gekweekt in monolaag zelden contract spontaan, omdat, bij het ontbreken van een zenuw component, celdifferentiatie is beperkt en motor neuron stimulatie ontbreekt 1. Deze beperkingen belemmeren in vitro onderzoek van vele neuromusculaire aandoeningen gekweekte spiercellen. Belangrijk is dat de experimentele beperkingen van monolayered, gekweekte spiercellen worden ondervangen door functionele innervatie van myofibers met ruggenmerg explantaten in co-culturen.
Hier wordt tonen verschillende stappen nodig zijn om een efficiënte goede innervatie van humane primaire spiercellen bereiken, waardoor differentiatie en vezels contractie af volgens de methode van Askanas 2. Om dit te doen, zijn spiercellen samen gekweekt met het ruggenmerg explantaten van de rat embryo's bij ED 13.5, met de achterwortelganglia nog aan het ruggenmerg plakjes. Na een paar dagen, de spier fileden beginnen te contracteren en uiteindelijk cross-dwarsgestreepte worden door innervatie door functionele neurieten dat uitsteekt uit het ruggenmerg explantaten dat de verbinding met de spiercellen. Deze structuur kan worden gehandhaafd gedurende maanden eenvoudig door geregelde uitwisseling van het kweekmedium.
De toepassingen van deze instrument van onschatbare waarde zijn talrijk, omdat dit een functioneel model voor multidisciplinaire analyses van de menselijke spierontwikkeling en innervatie. In feite een volledige de novo neuromusculaire installatie optreedt in een kweekschaal, waardoor een gemakkelijke meting van vele parameters bij elke stap in een fundamentele en fysiologische omgeving.
Gewoon om een paar voorbeelden, genomische en / of proteomische onderzoeken citeren kan direct worden uitgevoerd op de co-culturen. Bovendien kunnen pre-en post-synaptische effecten specifiek en afzonderlijk worden beoordeeld op de neuromusculaire verbinding, omdat beide componenten afkomstig zijn van verschillende soorten,rat en mens, respectievelijk. De zenuw-spier co-cultuur kan ook worden uitgevoerd met menselijke spiercellen geïsoleerd van patiënten die lijden aan spier-of neuromusculaire ziekten 3, en kan dus worden gebruikt als screening instrument voor kandidaat-medicijnen. Tenslotte is geen speciale apparatuur, maar regelmatige BSL2 inrichting nodig om functionele motorunit een kweekschaal reproduceren. Deze methode is dus waardevol voor de spier en de neuromusculaire onderzoekgemeenschappen fysiologische en mechanistische studies neuromusculaire functie, in normale en ziekte context.
Protocol
Discussion
Een fysiologische in vitro middel om spier-cel functie te bestuderen in normale en pathologische context is van de hoogste belang is voor de myologists, omdat spiercel culturen meestal niet herhalen het belang van meerdere cellen en cel-achtige verbindingen. De toevoeging van gezuiverde motorneuronen spier cellen niet genoeg om een functionele motorunit bereiken, aangezien de aanwezigheid van Schwann cellen vereist voor de innervatie om efficiënt 5 en het is niet topologisch (3D + speciale verdeling…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ons werk wordt ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (SNF), het Zwitsers initiatief in Systems Biology (SystemsX.ch), de Vereniging voor Musculaire Dystrofie USA (MDA), de Association Française contre les Myopathie (AFM), de Verenigde mitochondriale ziekte Foundation (UMDF), de Gebert-Rüf Stichting Zeldzame Ziekten Programme (GRF), de Zwitserse Vereniging voor Onderzoek van de spierziekten (SSEM / FSRMM), de Swiss Life "Jubiläumsstiftung für Volksgesundheit und Medizinische Forschung", de Roche Research Foundation en de Universiteit van Basel.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalog Number |
| HBSS | Gibco/Invitrogen | 14170 |
| MEM | Gibco/Invitrogen | 31095 |
| Medium 199 | Gibco/Invitrogen | 31153 |
| Fetal Bovine Serum | Fetal Clone Perbio | SH30066.03 |
| Insuline | Sigma | I9278 |
| Human EGF | Sigma | E9644 |
| Human FGF | Sigma | F0291 |
| Penicillin/streptomycin solution | Gibco | 15140 |
References
- Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions. Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).
- Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation. J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).
- Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy. Lancet. 345, 694-695 (1995).
- Askanas, V., Engel, W. K. A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture. Neurology. 25, 58-67 (1975).
- Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro. Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).
- Lefebvre, S. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell. 80, 155-165 (1995).
- Schrank, B. Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).
- Hsieh-Li, H. M. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).
- Monani, U. R. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).
- Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).
- Durbeej, M., Campbell, K. P. Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models. 12, 349-361 (2002).
- Schnabel, J. Neuroscience: Standard model. Nature. 454, 682-685 (2008).
- Benatar, M. Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS. Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).
- Dorchies, O. M. Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system. Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).
- McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies. Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).
