Intravital Mikroskopi af milten: Kvantitativ analyse af Parasite mobilitet og Blood Flow
Summary
Vi viser en metode til at udføre intravital mikroskopi af milten ved hjælp af GFP transgene malaria parasitter og kvantificering af parasitten mobilitet og blodgennemstrømningen inden for dette organ.
Abstract
Fremkomsten af intravital mikroskopi i eksperimentelle gnaver malaria modeller har gjort store fremskridt med viden om parasit-vært interaktioner 1,2. Således har in vivo imaging af malaria parasitter under pre-erythrocytkoncentrationen stadier afslørede aktive indgangen af parasitter ind i huden lymfeknuder 3, den fuldstændige udvikling af parasitten i huden 4, og dannelsen af en hepatocyt-afledt merosome at sikre migration og frigivelse af merozoites i blodet 5. Desuden har udviklingen af de enkelte parasitter i erytrocytter for nylig blevet dokumenteret ved hjælp af 4D billedbehandling og udfordrede vores nuværende syn på protein eksport i malaria 6. Således har intravital imaging radikalt ændret vores holdning til vigtige begivenheder i Plasmodium udvikling. Desværre, undersøgelser af de dynamiske passage af malaria parasitter gennem milten, en stor lymfoide organ udsøgt tilpasset for at rydde inficeret rød blood celler er mangler på grund af tekniske begrænsninger.
Brug af murine model af malaria Plasmodium yoelii i BALB / c mus, har vi implementeret intravital billeder af milt og rapporterede en differentieret ombygning af det, og overholdelse af parasitized røde blodlegemer (pRBCs) til barriere celler fibroblastic oprindelse i den røde pulpa under infektion med den ikke-dødelige parasit line P.yoelii 17x i modsætning til infektioner med P.yoelii 17XL dødelige parasit linje 7. For at nå disse konklusioner, blev for en specifik metode bruger ImageJ gratis software udviklet til at muliggøre karakterisering af de faste tre-dimensionelle bevægelse af single-pRBCs. Opnåede resultater med denne protokol tillader bestemmelse af hastighed, retning og opholdstid af parasitter i milten, alle parametre fat overholdelse in vivo. Hertil kommer, rapport vi metoden for blodgennemstrømningen kvantificering ved hjælp af intravital mikroskopi og brugen af DIFskellige farvestoffer at få indsigt i den komplekse mikrocirkulatoriske strukturen af milten.
Etik erklæring
Alle dyr blev udført på dyret faciliteter University of Barcelona i overensstemmelse med retningslinjer og protokoller, der er godkendt af den etiske komité for dyreforsøg fra University of Barcelona CEEA-UB (protokol nr. DMAH: 5429). Kvinde BALB / c mus af 6-8 ugers alderen blev indhentet fra Charles River Laboratories.
Protocol
Discussion
Gennemførelsen af intravital mikroskopi af milten i denne gnaver malaria model åbnet mulighed for at undersøge den dynamiske passage af parasitter gennem dette organ, som indtil nu har været betragtet som en "black-box" på grund af tekniske overvejelser. Herinde blev en stor indsats sat til at tilpasse en kvantitativ metode, der giver mulighed for sammenlignende analyser af forskellige parasit linjer på enkelt og befolkning niveauer. I modsætning til andre væv og celler, der var blevet afbildet f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er især taknemmelige for S. Graewe og V. Heussler for grunduddannelse og løbende input i intravital mikroskopi af malaria parasitter, til J. Burns for at donere GFP transgen parasitter, til A. Bosch (Konfokal Unit, det går stærkt ind-UB, IDIBAPS) for at få hjælp i billede analyse og kvantificering og P. Astola til teknisk bistand. Vi takker R. Tous og I. Caralt til videoproduktion. MF er en modtager af en kandidat stipendium fra den generelle betydning af Catalonien. HAP er en ICREA forskningsprofessor. Arbejde i laboratoriet af HAP er finansieret af Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under tilskudsaftale nr. 242095, af den selvejende institution Cellex (Catalonien, Spanien), og ved det spanske ministerium for videnskab og innovation ( SAF2009-07760).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Leica TCS-SP5 confocal microscope | Leica Microsystems, Heidelberg, Germany | TCS-SP5 Serial no. 5100000419 | |
| Ketamine (Ketolar 50 mg/ml) | Pfizer | 631028 | |
| Midazolam 15 mg/3 ml | Normon | 838193 | |
| 70,000 MW Dextran, conjugated to Texas Red | Molecular Probes | D1830 | |
| Fluorescein Isothiocyanate, isomer I (FITC) | Sigma | F7250 | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H1399 | |
| Giemsa stain | Sigma | GS1 | Working solution is at 10% in distilled water |
| Super Glue-3 Loctite | Loctite | 9975-0880 |
References
- Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites–recent advances and future directions. Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).
- Heussler, V., Doerig, C. In vivo imaging enters parasitology. Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).
- Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. Imaging malaria sporozoites. in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).
- Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).
- Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids. Science. 313, 1287-1290 (2006).
- Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions. Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).
- Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape. Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).
- Linden, M. v. a. n. d. e. r., R, . A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).
- Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein. 173, 33-38 (1996).
- Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy. Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Bowdler, A. J. . The complete spleen. , (2002).
- Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).
- Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).
- Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier. Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).
- Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen. J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).
- Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
