Fixação de Perfusão todo animal para Roedores

1. Preparar Fixador (Veja tabela de Fixação e Buffers.) 2. Prepare Buffers de perfusão (Veja tabela de Fixação e Buffers.) 3. Prepare Aparelhos e Anestesia Usando a água do banho, tampão de perfusão quente a 37 ° C. Válvula de saída lugar num copo cheio com tampão. Encha uma seringa de 50 ml com tampão e anexar ao tubo fixador. Lave tubulação repetidamente, expulsando e retirada do buffer. Limpar a linha com tampão até que todas as bolhas de ar na tubagem são eliminados. É essencial para o sucesso de um perfusão não ter bolhas de ar em qualquer das linhas. Retire a seringa e conecte o fixador paraformaldeído 4% (temperatura ambiente) do recipiente. Para evitar bolhas de ar na extremidade da tubagem, apertar o tubo, enquanto o posicionamento do tubo para dentro do recipiente de modo que uma gota de tampão sobressai a partir da extremidade tó contacto com a superfície do fluido no interior do recipiente. Feche o orifício de saída (extremidade da agulha). Coloque a válvula de tampão (azul) para a mesma posição que a válvula de fixador (branco). Isto irá permitir que o fluxo a partir da linha buffer apenas. Abra a porta de saída e repita o passo A1 a A3 para preencher a linha de buffer. Depois de todas as bolhas de ar são eliminados perto da porta de saída, remover a seringa e conectar o recipiente de buffer, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na tubulação. Sistema de teste para a capacidade de manter a pressão por bombagem do blub manómetro de borracha. Há normalmente alguma resistência, devido à compressão do ar no sistema. Instalação das Ferramentas de cirurgia para que de fácil acesso. Encha agulha de perfusão com tampão para eliminar a possibilidade de bolhas de ar. Antes da cirurgia, uma mistura de cetamina / xilazina (até 80 mg / kg de peso corporal de cetamina e 10 mg / kg de xilazina peso corporal) é administrado através de injecção intraperitoneal (27 agulha de calibre e uma seringa cc). Administração adicional de anestésico serão realizadas conforme necessário, durante o decurso de cada operação de manter um plano cirúrgico da anestesia. 4. Cirurgia de perfusão Uma vez que o animal tenha atingido um plano cirúrgico de anestesia, colocá-lo na bandeja rasa preenchido com gelo moído. (Use o dedo pitada resposta método para determinar a profundidade da anestesia. Animal deve ser responder antes de continuar). Faça uma incisão 5-6 cm lateral através do tegumento e da parede abdominal logo abaixo da caixa torácica. Cuidadosamente separar o fígado a partir do diafragma. Fazer uma pequena incisão no diafragma utilizando as curvas, a tesoura romba. A posição e da pressão do dedo pode auxiliar na capacidade de cortar o diafragma. Continuar a incisão diafragma ao longo de todo o comprimento da caixa torácica para expor a cavidade pleural. Coloque curvos, tesouras cegas longo de um lado das costelas, cuidadosamente deslocando os pulmões, e fazer uma cut através da caixa torácica até a clavícula. Fazer um corte semelhante no lado contralateral. Elevação do esterno longe, apare cuidadosamente qualquer tecido conectando-o ao coração. Prender a extremidade do esterno com o hemostato e colocar o hemostato sobre a cabeça. Quando feito corretamente, o timo levanta longe do coração junto com o esterno, proporcionando uma visão clara dos principais vasos sanguíneos. Faça uma pequena incisão para a extremidade posterior do ventrículo esquerdo, com tesoura de íris. Clique aqui para ver maior figura . Passa uma agulha de calibre 15-perfusão blunt-azeitona ou de ponta através do ventrículo corte na aorta ascendente. A ponta deve ser visível através da parede da aorta, e não deve atingir o arco aórtico onde as artérias carótida braquial e divergem. Usar uma hemostato para prender o coração, este assegura a agulha e evita o vazamento. Se desejado, o hemostato modificado pode ser utilizado para fixar a aorta em torno da ponta da agulha (estes hemostats permanecer no lugar até que começa dissecção, mas são omitidos ilustrações futuros para maior clareza). Finalmente, fazer uma incisão para o átrio direito do animal com uma tesoura de íris para criar uma grande tomada de uma possível sem danificar a aorta descendente. Neste ponto o animal está pronto para ser perfundido. 5. Perfusão Abra e anexar porta de saída para agulha de base tendo cuidado para não introduzir bolhas de ar. Bombear a lâmpada manómetro a uma pressão de 80 mm Hg de forma rápida e uniformemente. Manter esta pressão ao longo do período de infusão de tampão. Iniciar o temporizador. Ajustar o ângulo da agulha. O ângulo da agulha é crítica para a obtenção de uma taxa de fluxo máxima (note a mudança do fluxo com ajuste do ângulo). Mude o lustreer válvula (azul), uma vez tampão está quase terminada (200 ml). O fluido deve ser executado claro. A limpeza do fígado é um indicador de uma boa perfusão. O fígado deve ser claro neste ponto. Indique tempo para seus registros. Tremores de fixação devem ser observados dentro de segundos, o que deve ser considerado o tempo real de fixação. Indique tempo para seus registros. A pressão pode ser gradualmente aumentar até um máximo de 130 mm Hg 2 para manter uma taxa de fluxo constante. Feche a válvula de saída uma vez que o fixador está quase concluído. Indique terminando o tempo para seus registros. O rato deve ser duro nesta fase. O paraformaldeído usado deve ser recolhido e armazenado para eliminação de acordo com os regulamentos da sua instituição. 6. Dissecção 4,11 Retire a cabeça, usando um par de tesouras. Faça uma incisão na linha média ao longo do tegumento do pescoço até o nariz e expor ocrânio. Aparar o músculo do pescoço restante de modo que a base do crânio é exposta; remover qualquer músculo residual usando tesoura ou fórceps. Coloque a extremidade afiada de um par de tesouras íris para o forame de um lado, cuidadosamente deslizando as tesouras ao longo da superfície interna do crânio. Em seguida, fazer um corte estendendo-se para a extremidade distai da superfície posterior do crânio. Faça um corte idêntico ao lado contralateral. Utilize os fórceps para limpar o crânio em torno do cerebelo. Deslize cuidadosamente a tesoura ao longo da superfície interna do crânio como a ponta viaja a partir do canto distal dorsal posterior para a extremidade distai frontal do crânio, levantando a lâmina de corte à medida que são para evitar danos para o cérebro. Repita para o lado oposto. Usando fórceps casca da superfície dorsal do crânio para longe do cérebro. Aparar os lados do crânio usando fórceps tão bem. Usando uma espátula, cortar os bulbos olfatórios e conectores nervosoções ao longo da superfície ventral do cérebro. Gentilmente provocar o cérebro longe da cabeça, aparando qualquer dura que ainda liga o cérebro ao crânio com uma tesoura de íris. Remover o cérebro e colocá-lo em um frasco de fluido contendo pelo menos fixador 10x o volume do cérebro em si. Agitar o frasco ocasionalmente. 7. Pós-fixação e armazenamento Manter o cérebro em fixador durante 24 horas a 4 ° C, agitando ocasionalmente. Após 24 horas, lavar o cérebro com salina tamponada com fosfato, trocando os meios de comunicação 3 vezes e agitando a cada vez. Cérebros podem então ser armazenadas em solução salina tamponada com fosfato ou HBHS com azida de sódio e mantida a 4 ° C. 8. Os resultados representativos Um indicador do sucesso inicial da perfusão é a compensação das extremidades, como o nariz, orelhas e patas e órgãos internos, tais como a glândula timo e fígado (IHC Mundial).Inspeção bruta do cérebro revela o vazio vaso sanguíneo do sangue (branco a aparência amarelo-claro). Este será também verdade dentro das seções de tecido destinar para a coloração e imuno-histoquímica. O indicador final do resultado da perfusão é a condição de a ultraestrutura no tecido. 1,6,7,8 Preparar Fixador: Prepare estoque paraformaldeído 8% Adicionar 40 g de paraformaldeído a 500 ml dH 2 O. Aquecer a solução a 60 – 65 ° C enquanto se agita (Não exceda 65 ° C, fazendo assim que pode afectar negativamente o sucesso do procedimento imuno-histoquímica). Para limpar a solução, reduzir o calor e adicionar 2-3 ml de 1,0 M NaOH com um conta-gotas. Filtrar e armazenar a 4 ° C durante até 1 mês. Preparar 0,2 M tampão fosfato de sódio, pH 7,4 Para o sódio estoque de fosfato monobásico, adicionar 27,8 g NaH 2 PO 4 * H 2 O para 1 L dH 2 O. Para o sódio estoque de fosfato dibásico de sódio, adicionar 28,4 g de Na 2 HPO 4 a 1 L dH 2 O. Adicionar 810 ml de estoque monobásico a 190 ml de estoque dibásico. Prepare fixadora paraformaldeído 4% Adicionar partes iguais estoque paraformaldeído 8% para 0,2 M tampão fosfato de sódio Nota: esta correcção está mais bem preparado fresco, não mais que 72 horas de antecedência. Prepare Perfusão e buffers de armazenamento: Preparar tampão fosfato, pH 7,4 Solução Salina 1 L de dH2O 9 g de NaCl 144 mg KH 2 PO <sub> 4 795 mg de Na 2 HPO 4 Verifique o pH HEPES Hanks Solution (HBHS) com pH 7,4 Sódio Azida 990 ml de dH2O 7,5 g de NaCl, 0,3 g de KCl 0,06 g KH 2 PO 4 0,13 g de Na 2 HPO 4 2 g de dextrose / Glucose 2,4 g de 10 mM de HEPES 0,1 g de MgCl2 6 partes de dH2O 0,05 g MgSO4 7 partes de dH2O 0,165 g de CaCl2 2 partes de dH2O 90 mg de NaN3 Verifique o pH Tabela 1. Preparação de fixador e tampões. Figura 1. </strong> aparelho de perfusão com componentes marcados. Figura 2. Preparação da perfusão do Aparelho I. Comece com a linha de fixador. Lave o tubo de bolhas de ar e encha com tampão pela rápida expulsão e retirada do tampão para a seringa e através da linha. Fechar a válvula na extremidade da agulha fora. Coloque a linha fixador para a garrafa fixador sem a introdução de bolhas de ar. Figura 3. Preparação da perfusão do Aparelho II. 1. Abrir a válvula na extremidade da agulha. 2. Gire a válvula tampão (azul) para a posição para o fluxo. 3. Lave o tubo de bolhas de ar e encha com tampão pela rápida expulsão e retirada do tampão com a seringa. 4. Fechar a válvula na extremidade da agulha. Coloque tubo dentro da garrafa buffer. Pressão de teste para garantir que o sistema é selado corretaly por bombeamento até o bulbo manômetro e observando o medidor. O aparelho está agora pronto para o procedimento de perfusão. Figura 4. Aparelho de perfusão em posição para entrega tampão. Figura 5. Perfusão Cirurgia I. a) Faça uma incisão lateral através do tegumento e da parede abdominal. b) Fazer uma incisão no diafragma e atravessam o diafragma expor o coração. Fazer cortes paralelos em ambos os lados das costelas até a clavícula. c) fixar a extremidade do esterno com o hemostato e colocar o hemostato sobre a cabeça. Figura 6. Perfusion Cirurgia II. a) Passa a agulha de perfusão através do ventrículo corte na aorta ascendente. b) Assegurar operfusão agulha utilização um conjunto de hemostats para reprimir o coração. Um segundo conjunto de uma hemostato modificado pode também ser utilizado para fixar a aorta em torno da ponta da agulha para evitar fugas. Utilizando uma tesoura de íris fazer uma pequena incisão para a extremidade posterior do ventrículo esquerdo. Figura 7. Perfusion com bomba tampão a lâmpada manómetro para criar pressão na linha. Abra a válvula (1) e anexar ao cubo da agulha. É fundamental certificar-se há bolhas de ar são introduzidas. Bombear a lâmpada manómetro para uma pressão de 80 mm Hg e manter esta pressão ao longo do período de infusão de tampão. Figura 8. Perfusion com fixador Uma vez tampão está quase terminada (200 ml) alternar a válvula de tampão (1) para permitir o fixador de fluxo. A pressão pode ser gradualmente aumentada até ummáximo de 130 mm Hg. Figura 9. I. Dissecção a) retirar a cabeça, usando um par de tesoura. b) fazer uma incisão na pele ao longo da linha média do pescoço para o nariz e expor o crânio. c) aparar o músculo do pescoço restante de modo que a base do crânio é exposta. Segure a cabeça para que a grande abertura na superfície do crânio (forame magno) é acessível. Introduza cuidadosamente a ponta afiada de um par de íris tesoura para o forame magno e fazer um corte. Repita a mesma manobra para o lado contralateral. Utilize os fórceps para limpar o crânio em torno do cerebelo. Figura 10. Dissecção II. a) deslize cuidadosamente a tesoura ao longo da superfície interna do crânio. Levante a ponta como você está cortando para evitar danos ao cérebro. Repita a mesma paralado oposto. Use fórceps casca do crânio para longe do cérebro. b) ilustração com o crânio removido eo cérebro exposto. c) Utilização de uma espátula para cortar as lâmpadas olfactivas e conexões nervosas no local mais anterior do cérebro. Cuidadosamente orientar a ponta de espátula ao longo do lado de baixo do cérebro para cortar as ligações para a facilidade de remoção. Remover o cérebro e colocá-lo num frasco de fixador.