L'isolement des cellules de souris poumon dendritiques
Summary
Une préparation hautement purifiée de cellules de souris pulmonaires dendritiques est décrite. Un accent particulier est donné à l'isolement de sous-ensemble de cellules dendritiques conventionnelles.
Abstract
Cellules dendritiques pulmonaires (DC) jouent un rôle fondamental dans la détection des pathogènes envahisseurs 1,2 ainsi que dans le contrôle des réponses tolérogènes 3 dans les voies respiratoires. Au moins trois sous-ensembles principaux de cellules dendritiques pulmonaires ont été décrites chez la souris: DC conventionnelles (CDC) 4, DC plasmacytoïdes (pDC) 5 et le tueur de l'IFN-production DC (IKDC) 6,7. Le sous-ensemble CDC est le sous-ensemble DC les plus éminents dans les poumons 8.
Le marqueur commun connus pour identifier des sous-DC est CD11c, un type que je transmembranaire intégrines (β2) qui est également exprimé sur les monocytes, les macrophages, les neutrophiles et des cellules B 9. Dans certains tissus, en utilisant comme marqueur CD11c pour identifier la souris DC est valable, comme dans la rate, où la plupart des cellules CD11c + représentent le sous-ensemble des CDC, qui exprime des niveaux élevés de l'complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH-II). Toutefois, le poumon est un tissu plus hétérogène, où secôté des sous-ensembles DC, il ya un pourcentage élevé d'une population de cellules distinctes qui exprime des niveaux élevés de CD11c bout de faibles niveaux de CMH-II. Basé sur sa caractérisation et surtout sur l'expression de ses F4/80, un marqueur des macrophages spléniques, le CD11c Salut CMH-II de la population lo cellules du poumon a été identifié comme les macrophages pulmonaires 10 et plus récemment, comme un précurseur potentiel DC 11.
Contrairement à la souris PDC, l'étude du rôle spécifique de la CDC dans la réponse immunitaire pulmonaire a été limitée en raison de l'absence d'un marqueur spécifique qui pourrait aider dans l'isolement de ces cellules. Par conséquent, dans ce travail, nous décrivons une procédure pour isoler hautement purifiée de souris pulmonaires CDC. L'isolement des sous-ensembles DC pulmonaires représente un outil très utile afin de mieux connaître la fonction de ces cellules en réponse à des agents pathogènes des voies respiratoires ainsi que les facteurs environnementaux qui peuvent déclencher la réponse immunitaire de l'hôte dans les poumons.
Protocol
Discussion
L'isolement de la souris pulmonaires DC est une technique importante pour l'étude d'un large éventail de stimuli respiratoires. Le processus d'obtention de ces cellules comprend des étapes critiques qui empêchent la perte de cellules ainsi que la viabilité des cellules et la pureté. Perfusant le poumon avant la collecte aidera à éliminer toutes les cellules périphériques ainsi que de réduire les érythrocytes contaminant. L'utilisation de la dissociation peut être automatisé advanteogus …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Dietrich à Marilyn à l'installation de débit de base UGB Cytométrie pour son aide avec le tri cellulaire et Peter Mottram pour son aide avec les microphotographies. Ce travail a été financé par le Flight Attendant Institut de recherche médicale, le Prix du LSU-concurrentiel du Programme de recherche et les subventions du NIH / NIAID P20 RR020159 et R03AI081171.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| ACK lysing buffer | Invitrogen | D6-0005DG | |
| Anti-mouse CD11c (HL3) | BD Pharmingen | 5580979 | PE-Cy7 conjugated |
| Anti-mouse I-A/I-E (269) | BD-Pharmingen | 553623 | FITC conjugated |
| Collangenase Type 1A | Sigma | 9891-500MG | |
| Cell strainers | BD Falcon | 352340, 352360 | |
| CD11c (N418) Microbeads | Miltenyi | 130-052-001 | |
| DNase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Hank’s Balanced Salt solution | Invitrogen | 14170 | |
| Hepes buffer solution | Invitrogen | 15630 | |
| Petri dishes 60 mm | BD Falcon | 351016 | |
| GentleMACS™ C tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| Gentle MACS dissociator | Miltentyi | 130-093-235 | |
| AutoMACS-Pro™ | Miltenyi | 130-092-545 | |
| FASCS Aria | BD |
References
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