Efficiënte Recombinant Parvovirus productie met de hulp van Adenovirus-afgeleide systemen
Summary
Hier beschrijven protocol alleen gebaseerd op cel infectie, hetgeen het rendement van recombinant parvovirus productie van meer dan 100 maal in vergelijking met andere protocollen gebruikt verbetert. Dit protocol is gebaseerd op het gebruik van een nieuw adenovirus 5 gebaseerde helper met de parvovirus VP transcriptie-eenheid (Ad-VP).
Abstract
Knaagdieren parvovirussen (PV), zoals rat H-1PV en MVM, zijn kleine icosahedrale, enkelstrengs DNA-virussen. Hun genoom bevat twee promoters P4 en P38 die de expressie van niet-structurele (NS1 en NS2) en capside eiwitten (VP1 en VP2) respectievelijk een te regelen. Ze trekken een hoge rente als antikankermiddelen voor hun oncolytische en oncosuppressive vaardigheden terwijl ze niet-pathogeen voor de mens 2. NS1 de belangrijkste effector van virale cytotoxiciteit 3. Om verdere hun natuurlijke antineoplastische te verbeteren, zijn derivaten van deze vectoren zijn gegenereerd door vervanging van de gen dat codeert voor de capside eiwitten met een therapeutisch transgen (bijv. een polypeptide cytotoxische, cytokine, chemokine, tumor suppressor gen, enz.) 4. De recombinante parvovirussen (recPVs) vector behoudt NS1 / 2 coderende sequenties en de PV genoom telomeren die noodzakelijk zijn voor virale DNA-amplificatie en verpakking. Productie vanrecPVs komt alleen in de producerende cellen (doorgaans HEK293T) door co-transfectie van de cel met een tweede vector (pCMV-VP) het gen dat codeert voor de VP eiwitten (Fig. 1) 4. De recPV vectoren gegenereerd op deze manier zijn replicatie defect. Hoewel recPVs bleek verbeterde oncotoxic eigenschappen bezit met betrekking tot het ouderlijk virussen van waaruit ze zijn ontstaan, hun productie blijft een grote uitdaging en sterk belemmert het gebruik van deze middelen in de anti-kanker klinische toepassingen.
Wij vonden dat de invoering van een ad-5 afgeleide vector die het E2A, E4 (ORF6) en VA RNA genen (bijv. pXX6 plasmide) in HEK293T verbeterd productie van recPVs meer dan 10 maal in vergelijking met andere protocollen gebruikt. Op basis van deze vondst hebben we geconstrueerd een nieuwe Ad-VP-helper de genomische adenovirale elementen om recPVs productie verbeteren en de parvovir bevatons VP gen-eenheid 5. Het gebruik van Ad-VP-helper, maakt het mogelijk de productie van rec-PV's met behulp van een protocol dat volledig afhankelijk is van virale infectie stappen (in tegenstelling tot plasmide transfectie), het mogelijk maken van het gebruik van cellijnen die moeilijk te transfecteren (bijv. NB324K) ( Fig. 2). Wij beschrijven een methode verbetert de hoeveelheid geproduceerd recombinant virus, waardoor zowel de productietijd en kosten zonder dat de kwaliteit van het eindproduct 5. Bovendien, grootschalige productie van recPV (in suspensie cellen en bioreactoren) is nu denkbaar.
Protocol
Discussion
We hebben aangetoond dat recPV productie kan worden versterkt door de aanwezigheid van adenovirale genoom elementen. We hebben het recPV opbrengst van meer dan 10 maal (0,3 tot 5 TU / cel) door adenovirus genomische element via transfectie en niet meer dan 100-voudig co-infecteren van de cellen met Ad-VP-helper in combinatie met de in recPV vergelijking met conventionele protocollen. Het protocol beschreven kan verder worden geoptimaliseerd door het bepalen van de meest geschikte timing voor de levering van het adenovir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken het team van de DKFZ virus productie en ontwikkeling eenheid, met name Marcus Müller, Silvia Münstermann, Barbara Liebetrau, en Mandy Roscher. Deze studie is mede ondersteund door subsidies van het ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) en de Helmholtz Association in het kader van het Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle du Grand-Est gezamenlijk programma in de Toegepaste Tumor Virology.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Sigma | D5796 |
| MEM | Sigma | M4655 |
| Foetal Bovine Serum | PAA | A15-101 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 |
| Fugene | Roche | 047097050001 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300062 |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 |
| Adeno-X Rapid Titer Kit | Clontech | 632250 |
References
- Cotmore, S. F., Tattersall, P. Parvoviral host range and cell entry mechanisms. Adv. Virus. Res. 70, 183 (2007).
- Rommelaere, J. Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics. Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185 (2010).
- Hristov, G. Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species. J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).
- Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer. J. Virol. 6, 193-193 (2004).
- El-Andaloussi, N. Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus. Cancer Gene Ther. 18, (2011).
- Kestler, J. cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses. Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).
- Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J. Virol. 72, 2224 (1998).
- He, T. C. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509 (1998).
- Zolotukhin, S. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene. Ther. 6, 973 (1999).
- Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation. J. Virol. Methods. 63, 129 (1997).
- Wrzesinski, C. Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells. J. Virol. 77, 3851 (2003).
