Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

1. Etiketleme ve hücre sabitleme Hücre Çoğalması Etiketleme Reaktif (BrdU) başına ml (1 1000 seyreltme) 1 saat hücre kültürü orta hasat öncesi 1 mcL ekleyin. Etiketleme dönemi yavaş büyüyen hücreler için uzatılmış gerekebilir. Hasat hücrelere aspirat kültür ortamı ve fosfat ile iyice yıkayın tamponlu salin (PBS). Orta iyice izlerini silmek için tekrarlayın. PBS 3mm EDTA içeren hızlı bir şekilde üçüncü kez kültürlerin yıkayın ve iyice aspire. Her çanak 3mm EDTA içeren PBS küçük hacimli, 0.5 ml 6 cm çanak için idealdir. 22 ° C hücreleri ayırmak için yaklaşık 5 dakika inkübe edin. 15 ml konik boru transfer. Santrifüj hücreleri, pelet için 5 dakika için 500 xg'de süpernatant kaldırmak ve iyice PBS 100 mcL tekrar süspansiyon haline getirin. 5 ml,% 95 EtOH, damla damla ekleyerek karıştırın ise hücreleri saptamak. Bu aşamada, hücreler için en az 4 ° C'de saklanıray. 2. BrdU ve DNA denatüre ve boyama Pelet hücreler 5 dakika boyunca 500 xg'de hücreleri Santrifüj ve% 95 EtOH çıkarın. 1 ml 2N HCl ve% 0.5 Tx-100 vorteks ederken bir damla bilge moda ekleyerek yeniden süspanse edin. 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Bölüm 2.1 'de daha önce olduğu gibi santrifüj ve hücrelerin bu aşamada çok gevşek bir granüle beri dikkatle supernatant aspire. 0.1M NAB 4 O 7 (pH 8.5) 1 mL yavaşça tekrar süspansiyon ve en az 30 dakika oda sıcaklığında inkübe. Yukarıda bölüm 2.1 ve 0.5 mL (PBS% 1 BSA ve% 0.2 Tween-20 içeren) fare anti-BrdU antikorlar ile antikor çözüm olarak tekrar süspansiyon Pelet hücreleri 50 1 sulandırılmış. 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Pelet hücreleri tekrar FITC için konjuge tavşan anti-fare sekonder antikor antikor çözüm içeren 50 ml içinde tekrar süspansiyon 25 1 sulandırılmış. 30 dakika boyunca inkübeMasaüstü ve ışıktan korumak. Santrifüj hücreleri son kez tekrar süspansiyon propidium iyodür ve RNaz solüsyonu (% 1 BSA ile PI-RNAse çözümü, PBS, 10 mg / ml propidium iyodür, 0.25 mg / ml RNaz A) 0,5 mL ve 37 karanlıkta inkübe ° 30 dakika C Alternatif RNA gece 4 sindirilemez ° C karanlıkta. Agrega kaldırmak ve akış sitometresinin örnek alımı için uygun bir tüp içinde tek hücre toplamak için çözüm bir hücre süzgecinden geçirin. Yine örnekleri gün ışığına doğrudan maruz korunmalıdır. 3. Flow sitometri analizi Hücreler propidium iyodür ve FITC için uygun algılama yeteneğine sahip çiftlerin (biri olarak akış hücresi geçmesi iki hücre) karşı ayrımcılık yapan, standart bir akış sitometresinde analiz edilmelidir. Tek hücreleri forward scatter ve yan dağılım pop dayalı etkinlikler için bu akış sitometri uygulaması gating ile tespit edilebilirulations ve propidium iyodür DNA boyama özelliklerini kullanarak. Giyilen erkek yeleği ayrımcı bir nokta komplo görünümünü akış sitometrelerinde propidium iyodür boyama özelliklerini dayanır arasında değişir, giyilen erkek yeleği discriminator analizi kurma hakkında bilgi için yerel flow sitometri tesisi bakın. Genel olarak, bir hücre eşzamansız hızla çoğalan nüfus, tek hücreler genellikle elektronların ikili ayrımcı arsa içinde en bol bulunan iki tepeler (2N ve 4N DNA) ve bir kapı çevrelerindeki çizilmelidir. Bu, aşağıdaki tüm sonraki analiz için kullanılan tek hücreli olayları seçin. Ilk numune analiz edilecek boyama ve akış sitometresi set-up için pozitif bir kontrol olarak hizmet veren bir eşzamansız prolifere kültür olmalıdır. Tekli hücrelerin 2N ve 4N doruklarına X ekseni üzerinde 200 ve 400 (keyfi birimleri) merkezli olduğunu propidium iyodür boyama photomultiplier tüplerin hassasiyetini ayarlayın. Biz genellikle bol s lekeBu örnek kullanmadan akış sitometresinin tüm parametreleri uygun şekilde ayarlanmış olması sağlamak için bu hücrelerin upply. Bu pozitif kontrol yeni kullanıcılar akış sitometresinin operasyon daha aşina olmak için de yararlı olur. G1 ve G2 / M popülasyonları arka plan üstünde olduğunu FITC tespiti için photomultiplier tüp hassasiyetini ayarlayın. BrdU pozitif hücrelerin yaklaşık 10 kat daha parlak ve Y ekseni logaritmik bir ölçek olarak gösterilmesi gereken yapılmalıdır. Bu olumlu boyanan hücreler açıkça ayırt BrdU boyama için bir negatif kontrol (non-spesifik IgG ile anti-BrdU antikorlar yukarıda 2.3 adımda değiştirerek) dahil etmek için bazen yararlı olabilir. Alt G1 akış sitometresinin formu, bir at nalı şeklinde yay tarafından yakalanan tek olaylar S-faz kadar sol ve aşağı G2 / M için sağ alt propidium iyodür ve FITC arasındaki tazminat ayarlayın Derinlik dis daha fazla bilgi için aşağıdaki referans bakınızorada özel uygulamalar için 2 flow sitometri ve referanslar ilkeleri ve kullanım cussion. 4. Veri analizi 5 000 10 000 DNA içeriği istenen aralık tek bir hücre olayları hücre kültürü nüfus iyice örneklenmiş olduğunu güven için, her bir örnek için alınmalıdır. Hücreleri G1, S veya G2 / M aşamalarında atanmış olması gerekir propidium iyodür ve BrdU içerik için ölçülmüştür. Yaklaşık 200 ve 400 (sırasıyla G1 ve G2 / M) merkezli iki BrdU negatif popülasyonları kapıları çizerek bunu yapın. S-faz (Şekil 1A) ölçen bir tek kapısı bu kutuları üzerinde her şey dahil edilmelidir. Her kapı hücrelerin yüzdesi G1, S ve G2 / M (Şekil 1B) hücrelerin göreli sayısını temsil eder. 5. Alternatif, hücrelerden oluşan bir karışık bir nüfus hücre döngüsü analizi için protokol Bu alternatif bir protokoldüren yararlı zaman hücre saf bir nüfusu belirlemek için ilaç tedavisi pratik ifade vektörlerin transfeksiyon rutin ilgi gen ürünü eksprese eden hücrelerin düşük bir yüzde ile sonuçlanır. Büyük bir nüfus ile kontamine olan ilgi hücreleri nispeten küçük bir oranı bu sonuçlar hücreleri untransduced. Bu durumda, gen ya da ilgi shRNA ifade CD19 4 veya GFP 3 demirlemiş bir zar gibi flow sitometri, veya yabancı bir hücre yüzey işaretleyici transfekte hücreler tespit için bir işaretleyici ifade eden bir plazmid ile birlikte eş-transfect plazmid CD20 5. Bu protokolün amaçları için bir örnek olarak CD20 boyama Ancak, CD19 için boyama özünde aynıdır. CD20 ile transfeksiyon durumunda, BrdU etikete gerek yoktur, sadece 20 mcL FITC konjuge anti-CD20 antikorları i hücreler ekleyerek yukarıdaki adımları 1.2 1.5 açıklanan ve leke gibi hasat hücrelerice için 20 dakika karanlık. Adım 1.6 'da açıklandığı gibi hücreler Fix. Hücreler tekrar 4 en az bir ay boyunca saklanabilir ° C karanlıkta. GFP tespiti için, bu adımı ve düzeltmek antikor boyama atlarsanız açıklandığı gibi hücreleri saklamak. 5 dakika boyunca 500 xg'de santrifüj pelet ve 5 ml PBS% 1 BSA içeren resuspending Re-hidrat hücreleri. Propidium iyodür ve RNaz çözüm bölüm 2,5 yukarıda açıklandığı gibi 0,5 mL 5 dakika tekrar süspansiyon hücreleri için 500 xg'de Re-pelet hücreleri. 3.1 ve 3.2 'de 2.6 ve analiz talimatları hücre hazırlama talimatları izlemeye devam edin. Photomultiplier tüp lekesiz hücrelerin arka plan üstünde olduğunu FITC algılama hassasiyetini ayarlayın. İdeal olarak, CD20-FITC pozitif hücrelerin arka plan daha 100X daha yoğun lekeli 10X olacak ve bu komplo Y ekseni logaritmik ölçek olarak gösterilir (Şekil 2A) olmalıdır. Backg daha 10X parlak CD20 pozitif hücrelerinŞekil olarak yuvarlak (200 ve 400 yılları arasında propidium iyodür boyama) histogram propidium iyodür karşı hücre sayıları görüntülemek için seçilmiş olmalıdır. 2C. CD20 pozitif cut-off kolayca 10X planda olmalıdır (100X arka plan yukarıda yani 10X) parlak lekeli belirteçler ifade hücre hatları için. Ilgi genin de bu hücrelerin zayıf bir ifade, çünkü zayıf boyama hücrelerinin alınması, muhtemelen bu deneyler değişkenlik artar. Sadece zayıf lekeli CD20 pozitif (10X arka plan daha az yani), verim hücre hatları kesti belirlenmesi CD20 lekeli, untransfected hücreleri oluşan bir negatif kontrol kullanılarak yapılmalıdır. En az 1000 CD20 pozitif olayların, her bir numune için alınmalıdır. 1000 olaylarının daha az olduğu deneyler yüksek değişkenlik üretecektir. ModFit LT (Verity Yazılımı), Çoklu Çevrim AV (Phoenix Akış Sistemleri) ve Akış Jo (Ağaç Star) gibi yazılım paketleri matematiksel tahminleriŞekil gibi histogramlar eğrinin şekline katkıda bulunan G1, S ve G2 / M popülasyonları. 2B ve C 6. Temsilcisi Sonuçlar: Biz üç örnek yaklaşımlar kullanılarak deneysel hücre döngüsü analizleri sunuyoruz. Ilk fare embriyonik fibroblastlar siklin bağımlı kinaz inhibitörü p27KIP1 retroviral bir ifade kullanır. Viral enfeksiyon için ilaç seçimi tam yirmi dört saat sonra, hücreler, bir saat için nabız BrdU ile etiketli. Bu deneyde inhibitörü ektopik ifade hücrelerin yayılması (Şekil 3A ve B) tutuklamak için kullanılır. Şekil. 3B küçük BrdU pozitif olayların p27 yanıt S-faz kapı açıktır. Aynı şekilde, Şekil diagramed olarak p27 ifade hücreler için S-faz hücre yüzdesi oldukça düşüktür. 3C. Bu tip analizler g çeşitli suşları türetilmiş hücre hücre döngüsü kontrol kusurları karakterize çok etkili olmuşturfarelerin 6, 7, 8 ene hedefli. İkinci deneyde, 24 saat boyunca büyüme faktörü beta (TGF-β1) dönüştürerek, araştırıcıların bulgularıyla meme epitel hücreleri (MCF10A) büyüme inhibitör sitokin ile tedavi edildi. Hücreler dört saat boyunca hemen önce hasat BrdU ile etiketlenmiş. Şekil. TGF-β1 sinyal S-faz hücreleri (4) BrdU etiketleme büyük ölçüde azalır, bizim boyamanın özgüllüğü de IgG negatif kontrol (Şekil 4C) ile doğrulanır. Hücre döngüsünün farklı aşamalarında Niceleme bu TGF-β1, öncelikle bu aşamada bir birikimine yol açan hücre siklusunun G1 fazında proliferasyonunu inhibe onaylar. En son örnek, pRB eksik Saos-2 hücrelerinin CMV CD20 ekspresyon vektörü ve CMV-RB veya kontrol olarak CMV-β-Gal ya transfekte. Transfeksiyon hücreleri izleyen üç gün, hasat, lekeli, ve fikse edildi. Bu hücre Flow sitometri analiziŞekil. 5. Bu negatif kontrol transfekte hücreler (Şekil 5A) 72 saat pRB ifade dağılımı (Şekil 5B) ile karşılaştırıldığında, hücre döngüsü dağılımı göstermektedir. Çoklu Döngü yazılım tarafından eğri uydurma sonra, hücre döngüsü evreleri oranının doğrudan bir karşılaştırma Şekil. 5C. Bu, hücrelerin G1 aşağıdaki pRB ifade S ve G2 / M evreleri hücrelerinin birikimi ve göreli tükenmesi ortaya koymaktadır. Biz G1 tutuklama mekanizmalarının yaygın olarak 9, 10, 11, 12, 13 prob Bu testte kullanılan varyasyon var. Bu örnekler, hücre döngüsü kontrolü, çeşitli uyaranlar veya hücre manipülasyonlar yanıt nasıl ölçülebilir göstermektedir. Bu yaklaşım, bu nedenle kültür tip deneylerde hücre döngüsü pozisyonu ölçümü gerektiren pek çok uygulama için adapte edilebilir. Şekil 1. Quantithücre döngüsü aşamalarında kombine propidium iyodür ve BrdU boyama (PI-BrdU) tarafından ation. (A) Bu panel, üç boyutlu propidium iyodür ve BrdU boyanan hücrelerin flow sitometri görüntüler. 2N ve 4N DNA içeriği ile hücreleri propidium iyodür boyanması yoğunluğu için 200 ve 400 X ekseni ölçekte işaretleri üzerinden merkezli olduğunu unutmayın. BrdU boyanma yoğunluğu Y ekseni bir logaritmik ölçekte ölçülür. , Hücrelerin, hücre döngüsü G1, S ve G2 / M aşamalarında ölçmek için kullanılabilecek kapılarının konumu unutmayın. (B) A G1, S ve G2 / M kapılarının her hücre oranı bu grafik üzerinde gösterilmiştir. Şekil 2 propidium iyodür ve hücre yüzey belirteci CD20 kullanarak seçili hücrelerin hücre döngüsü evreleri kantitasyonu. (A) Bu panel propidium iyodür ve hücrelerden oluşan bir karışım için CD20 boyanma gösterir, bazıları ektopik CD20 ve pRB ifade. Not hücrelere2N ve 4N DNA (en bol bulunan nüfus) X ekseni üzerinde 200 ve 400 işaretleri üzerinden ortalanır. CD20 + kapısının konumu, arka planda en az 10 kat daha parlak bir lekeli hücreleri seçer. (B) propidium iyodür boyama karşı hücre sayıları bir grafik bir eşzamansız yaygınlaşması panel CD20 negatif hücreler için gösterilmiştir. (C) benzer bir grafik panelinden CD20 pozitif hücreler için gösterilen pRB ifade ile tutuklama öncelikle 2N DNA içeriği ile hücreleri içeren ve ikna edilmiştir. Bu tutuklandı alt nüfus bu boyama tekniği kullanarak bu kültürün diğer hücrelerden ayırt edilebilir olduğunu göstermektedir. Şekil 3, p27KIP1 tarafından hücre proliferasyonu inhibisyonu . (A) PI-BrdU analizi, boş bir pBABE retroviral vecto transduced hücrelerin bir eşzamansız hızla çoğalan nüfus hücre döngüsü aşamaları ölçmek için kullanılanr. (B) hücrelerin benzer bir analizi pBABE-p27 ile transduced. S-faz ve G1 ve G2 / M kapıları olayların büyük yoğunluğu hücre olmadığına dikkat edin. (C) eşzamansız kontrolü ve p27 ifade hücreleri prolifere hücre döngüsü ilgili aşamalarında hücreler kantitasyonu. Şekil 4, TGF-β1 hücre proliferasyonu inhibisyonu eşzamansız MCF10A hücreleri prolifere olan (A) PI-BrdU analizi . 24 saat boyunca 100 pM TGF-β1 ile muamele edilen hücreler (B) Analiz. Öncelikle hücre siklusunun G1 fazında hücre birikimi unutmayın. (C) eşzamansız hızla çoğalan hücreleri non-spesifik IgG kontrolü ile anti-BrdU primer antikor yerine BrdU boyama onaylanması. (D) Grafik ilgili hücre döngüsü aşamalarının kantitatif A ve B. <br/> Şekil 5 pRB hücre proliferasyonu inhibisyonu. (A) CD20 propidium iyodür boyama ve ß-gal transfekte hücreler karşı Hücre sayıları gösterilmiştir. Transfekte alt nüfus için uygun olmayan bir kontrol olarak transfeksiyon kısmen untransfected nüfus (hücreler CD20) render, hücreleri senkronize olarak bu önemli bir kontrol. Transfekte hücreler diğer analog transfekte hücreleri ile karşılaştırıldığında gerekir. (B) Hücre sayımları karşı CD20 ve pRB propidium iyodür grafik hücreleri transfekte. 2N bir tepe neredeyse tek varlığı unutmayın. (C) Çoklu Döngü yazılım eğri uydurma yöntemleri kullanılarak A ve B hücre döngüsü faz oranlarda grafiksel gösterimi belirlenir.