Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

1. Rotulagem e fixação de células Adicionar 1 mL de Reagente Labeling Proliferação Celular (BrdU) por mL de meio de cultura celular (1-1000 diluição) 1 hora antes da colheita. O período de rotulagem pode precisar ser aumentado para mais lento células de crescimento. Às células colheita, meio de cultura aspirado e lavar cuidadosamente com tampão fosfato salino (PBS). Repita o procedimento para remover completamente os traços de médio porte. Lavar as culturas rapidamente uma terceira vez com PBS contendo EDTA 3mm e aspirar completamente. Adicionar um pequeno volume de PBS contendo EDTA 3mm a cada prato, 0,5 mL de um prato 6 centímetros é o ideal. Incubar a 22 ° C por aproximadamente 5 minutos para separar as células. Transferir para um tubo cônico de 15 mL. Células Centrifugar a 500 xg por 5 minutos para pellet, remover o sobrenadante e ressuspender completamente em 100 L de PBS. Fix células adicionando 5 mL de EtOH 95%, gota a gota, enquanto vórtex. Nesta etapa, as células podem ser armazenadas a 4 ° C durante pelo menos ummês. 2. Desnaturação e coloração de BrdU e DNA Centrifugar a 500 xg células por 5 minutos para as células pellet e remover EtOH 95%. Ressuspender em 1 ml de HCl 2N e 0,5% Tx-100, acrescentando de forma gota sábios quando vórtex. Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Centrífuga como antes na seção 2.1 e aspirar cuidadosamente o sobrenadante vez que as células formam um pellet muito solto nesta etapa. Delicadamente ressuspender em 1 ml de 0,1 M NAB 4 O 7 (pH 8,5) e incubados por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente. Células pelota como acima na seção 2.1 e ressuspender em 0,5 mL de solução de anticorpos (PBS contendo 1% de BSA e 0,2% Tween-20) com o mouse anti-BrdU anticorpos diluídos 1-50. Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Células de pelotas de novo e ressuspender em 50 mL de solução contendo anticorpo de coelho anti-rato anticorpos secundários conjugados com FITC diluído 1 a 25. Incubar por 30 minutos embancada e proteger da luz. Células centrífuga vez que uma final e ressuspender em 0,5 mL de iodeto de propídio e solução de RNase (PI-RNAse solução PBS com BSA 1%, 10 mg / mL de iodeto de propídio, 0,25 mg / mL de RNase A) e incubar no escuro a 37 ° C por 30 minutos. Alternativamente RNA pode ser digerido durante a noite a 4 ° C no escuro. Passe solução através de um filtro para remover células agregados e coletar células individuais em um tubo adequado para a captação de exemplo no seu citômetro de fluxo. Novamente, as amostras devem ser protegidas da exposição direta à luz. 3. A análise por citometria de fluxo As células devem ser analisadas por um citômetro de fluxo padrão que é capaz de discriminar doublets (duas células que passam através da célula de fluxo como um) com capacidade de detecção apropriados para propidium iodeto e FITC. Células individuais podem ser detectados no presente pedido de citometria de fluxo pela passagem para eventos baseado em dispersão para a frente e lado pop dispersãolamentos, e usando as propriedades de coloração de DNA pelo iodeto de propídio. A aparência de um gráfico de pontos doublet discriminação varia entre citómetros de fluxo e se baseia em propriedades coloração propidium iodeto, ver suas instalações citometria de fluxo locais para aconselhamento sobre a criação de um discriminador doublet em sua análise. Em geral, em uma população de maneira assíncrona proliferação de células, as células individuais são geralmente os dois picos mais abundante (2N e 4N DNA) na parcela doublet discriminar e um portão deve ser elaborado em torno deles. Isso irá selecionar os eventos única célula que são utilizados para todas as análises subseqüentes abaixo. A primeira amostra a ser analisada deve ser uma cultura de forma assíncrona proliferando que serve como um controle positivo para a coloração e citômetro de fluxo set-up. Ajustar a sensibilidade de tubos fotomultiplicadores para propidium coloração iodeto de tal forma que os picos 2N e 4N a partir de células singlet estão centradas em 200 e 400 (unidades arbitrárias) no eixo-X. Que muitas vezes mancha uma abundante supply dessas células para garantir que todos os parâmetros do citômetro de fluxo foram ajustados de forma adequada sem usar essa amostra. Este controle positivo também é útil para os novos usuários a se familiarizar com o funcionamento do citômetro de fluxo. Ajustar a sensibilidade do tubo fotomultiplicador para detecção FITC tais que as populações G1 e G2 / M estão acima do fundo. Células BrdU positivas devem ser aproximadamente 10 vezes mais brilhante eo eixo Y deve ser exibido como uma escala logarítmica. Às vezes é útil incluir um controle negativo para a coloração de BrdU (substituindo os anticorpos anti-BrdU com os não-específicos de IgG no passo 2.3 acima) para distinguir claramente células marcadas positivamente. Ajustar a compensação entre propidium iodeto e FITC tal que eventos únicos capturados pelo formulário citômetro de fluxo de um arco de ferradura em forma de G1 no canto inferior esquerdo até S-fase e para baixo no canto inferior direito para o G2 / M. Por favor, consulte a seguinte referência para uma análise mais profunda discussão dos princípios e uso de citometria de fluxo e referências lá para aplicações específicas 2. 4. A análise dos dados 5 000 a 10 000 eventos única célula com a gama de conteúdo pretendido DNA devem ser coletados para cada amostra, a fim de ter a confiança que a população de células na cultura têm sido exaustivamente amostradas. Uma vez que as células têm sido medidos para propidium iodeto e conteúdo BrdU eles precisam ser atribuídos às fases G1, S ou G2 / M. Faça isso pelo desenho portões em torno das duas populações BrdU negativos centrados em 200 e 400 (G1 e G2 / M, respectivamente). Acima de tudo estas caixas devem ser incluídos em uma única porta que mede S-fase (Fig. 1A). A porcentagem de células em cada porta representa o número relativo de células em G1, S e G2 / M (Figura 1B). 5. Protocolo alternativo para a análise do ciclo celular em uma população mista de células Este protocolo alternativo émais útil quando a transfecção de vetores de expressão rotineiramente resulta em uma baixa percentagem de células que expressam o produto do gene de interesse, ou quando o tratamento medicamentoso para selecionar uma população pura de células é impraticável. Isso resulta em uma proporção relativamente pequena de células de interesse de ser contaminada com uma grande população de células untransduced. Neste caso, co-transfecção de plasmídeos expressando seu gene ou shRNA de interesse juntamente com um plasmídeo que expressa um marcador para a detecção de células transfectadas por citometria de fluxo, como uma membrana ancorada GFP 3, ou um marcador de superfície externa de células, tais como CD19 4 ou CD20 5. Para efeitos do presente protocolo, vamos utilizar coloração CD20 como um exemplo, no entanto, coloração para CD19 é essencialmente idêntica. No caso de transfecção com CD20, não há necessidade de rotular BrdU, simplesmente células colheita conforme descrito nas etapas 1,2-1,5 acima e mancha pela adição de 20 mL FITC conjugado anti-CD20 anticorpos para as células na ice por 20 minutos no escuro. Fix células, como descrito em 1.6 passo. Células podem novamente ser armazenados por pelo menos um mês a 4 ° C no escuro. Para a detecção de GFP, omitir a coloração de anticorpos a partir desta etapa e corrigir e armazenar células como descrito. Re-hidratar as células por peletização na centrífuga a 500 xg por 5 minutos e ressuspensão em 5 mL de PBS contendo BSA 1%. Re-agregar as células a 500 xg por 5 minutos e ressuspender as células em 0,5 mL de iodeto de propídio e solução de RNase, como descrito acima na seção 2.5. Continue a seguir as instruções de preparação de células em 2,6 e análise instruções em 3.1 e 3.2. Ajustar a sensibilidade do tubo fotomultiplicador para detecção FITC tal que não coloridas estão acima do fundo. Idealmente, CD20-FITC células positivas será 10X a 100X mais intensamente manchado do fundo eo eixo Y deste lote deve ser exibido como uma escala logarítmica (Fig. 2A). Células CD20 positivas que são mais brilhantes do que 10X background (e com coloração propidium iodeto de entre 200 e 400) devem ser selecionados para exibição em um iodeto de propídio contra a contagem de células histograma como mostrado na figura. 2C. Para linhagens de células que expressam marcadores que são facilmente coradas intensamente (10X ou seja, a 100X acima do fundo), o CD20 positivo de corte deve ser definido no fundo de 10X. Inclusão de células mais fraca coloração aumenta a variabilidade nesses experimentos, presumivelmente porque o gene de interesse também é fracamente expresso nessas células. Para linhas de celular que só o rendimento fracamente coradas CD20 positivos (ou seja, menos do que o fundo de 10X), determinação de um off corte deve ser feito usando um controle negativo composto por CD20 manchadas, as células untransfected. Pelo menos 1000 CD20 eventos positivos devem ser coletados para cada amostra. Experimentos com menos que 1000 irá produzir eventos alta variabilidade. Pacotes de software, tais como ModFit LT (Verity Software), Multi AV Ciclo (Phoenix Sistemas de Fluxo), e Jo Flow (Árvore Star) utilizar estimativas matemáticas deas populações G1, S e G2 / M que contribuem para a forma da curva em histogramas como os mostrados na figura. 2B e C. 6. Resultados representativos: Nós fornecemos três exemplos de análises célula experimental, utilizando o ciclo nossas abordagens. O primeiro usa a expressão retroviral inibidor da ciclina dependente p27KIP1 quinase em fibroblastos do ratinho embrionárias. Vinte e quatro horas após a seleção da droga para a infecção viral foi completa, as células foram marcadas com BrdU pulso durante uma hora. Neste experimento expressão ectópica do inibidor é usado para prender a proliferação das células (Fig. 3A e B). Como mostrado na figura. Eventos 3B pouco BrdU positivas são evidentes no portão fase S em resposta a p27. Da mesma forma, a porcentagem de células em fase S de células que expressam p27 é bastante baixo conforme ilustrado na figura. 3C. Este tipo de análise tem sido muito eficaz na caracterização da célula defeitos ciclo de controle em células derivadas de várias cepas de gene-alvo camundongos 6, 7, 8. No segundo experimento, não transformado células epiteliais mamárias (MCF10A) foram tratadas com a citocina inibitória de crescimento, transformando beta do fator de crescimento de um (TGF-β1) por 24 horas. As células foram marcadas com BrdU por quatro horas imediatamente antes da colheita. Como mostrado na figura. 4 rotulagem BrdU na fase S-células é muito diminuída por TGF-β1 sinalização, a especificidade da nossa coloração também é validado com um controle IgG negativo (Fig. 4C). Quantificação das diferentes fases do ciclo celular confirma que TGF-β1 principalmente inibe a proliferação na fase G1 do ciclo celular, levando a um acúmulo nesta fase. Em nosso último exemplo, pRB deficiente SAOS-2 células são transfectadas com um vetor CMV-CD20 expressão e quer CMV-RB ou CMV-β-Gal como um controle. Três dias após transfecção as células foram colhidas, coradas e fixo. Análise de citometria de fluxo dessas célulass é mostrado na figura. 5. Isso demonstra a distribuição do ciclo celular de células transfectadas controle negativo (Fig. 5A), em comparação com a seguinte distribuição de 72 horas de expressão PRB (Fig. 5B). Após ajuste de curva por software Ciclo Multi, uma comparação direta da proporção de fases do ciclo celular é mostrado na figura. 5C. Isso revela o acúmulo de células em G1 expressão pRB seguinte eo esgotamento relativo de células das fases S e G2 / M. Temos usado variações sobre este ensaio para sondar mecanismos prisão G1 extensivamente 9, 10, 11, 12, 13. Estes exemplos demonstram como controle do ciclo celular pode ser medido em resposta a uma variedade de estímulos ou manipulações de células. Esta abordagem pode ser adaptada para muitas aplicações que requerem a mensuração da posição do ciclo celular em experimentos tipo de cultura. Figura 1. Quantitção das fases do ciclo celular por iodeto de propídio combinado e coloração BrdU (PI-BrdU). (A) Este painel exibe três citometria de fluxo dimensional de iodeto de propídio e células coradas BrdU. Note-se que as células com conteúdo de DNA 2N e 4N estão centradas sobre os 200 e 400 marcas na escala do eixo X para propidium intensidade de coloração de iodeto. BrdU intensidade de coloração é medido em uma escala logarítmica no eixo Y. Observe a posição dos portões usados ​​para quantificar células nas fases G1, S e G2 / M do ciclo celular. (B) A proporção relativa de células em cada um dos portões G1, S e G2 / M de A são mostrados neste gráfico. Figura 2. Determinação quantitativa de fases do ciclo celular em células selecionadas usando iodeto de propídio ea célula CD20 marcador de superfície. (A) Este painel mostra iodeto de propídio e CD20 coloração para uma mistura de células, algumas das quais ectopicamente expressar CD20 e pRb. Note-se que as células com2N e 4N DNA (as populações mais abundantes) estão centradas sobre os 200 e 400 marcas no eixo-X. A posição do CD20 + portão seleciona as células que estão manchadas pelo menos 10X mais brilhante do que de fundo. (B) Um gráfico de contagens de células versus propidium coloração iodeto é mostrado para CD20 células negativas no painel A que são assincronamente proliferando. (C) Um gráfico semelhante é mostrado para CD20 células positivas a partir do painel A que foram induzidos a prisão com a expressão pRB e contêm células com conteúdo de DNA principalmente 2N. Isso demonstra que um preso sub-população podem ser distinguidos de outras células nesta cultura usando esta técnica de coloração. Figura 3. Inibição da proliferação celular por p27KIP1. (A) PI-BrdU análise é usado para medir as fases do ciclo celular em uma população de maneira assíncrona proliferação de células que foram transduzidas com um vecto pBABE vazio retroviralr. (B) Uma análise similar das células transduzidas com pBABE-p27. Observe a ausência de células na fase S e maior intensidade de eventos no G1 e G2 / M portões. (C) A determinação quantitativa de células em cada fase do ciclo celular em forma assíncrona proliferação e controle de células que expressam p27. Figura 4. Inibição da proliferação celular por TGF-β1 (A) análise PI-BrdU de forma assíncrona proliferação de células MCF10A. (B) Análise das células tratadas com 100 pM de TGF-β1 por 24 horas. Observe o acúmulo de células principalmente na fase G1 do ciclo celular. (C) Validação de BrdU coloração, substituindo o anticorpo anti-BrdU primária com um controle de IgG não-específicas em células de forma assíncrona proliferando. (D) quantificação gráfica das fases do ciclo celular respectivos de A e B. <br/> Figura 5. Inibição da proliferação celular por pRb. (A) A contagem de células contra coloração iodeto de propídio de CD20 e gal-ß células transfectadas é mostrado. Este é um controle importante como a transfecção pode sincronizar parcialmente as células, tornando a população untransfected (CD20 – células) como um controle inadequado para o transfectadas sub-população. Células transfectadas precisam ser comparados com outras células transfectadas de forma análoga. (B) A contagem de células contra gráfico iodeto de propídio de CD20 e pRb transfectadas células. Note a presença quase exclusiva de um pico 2N. (C) Representação gráfica de proporções de células determinada fase do ciclo de A para B e usando métodos de ajuste de curva em software Ciclo Multi.