Analisi della posizione ciclo cellulare nelle cellule di mammifero

1. Etichettatura e di fissaggio delle cellule Aggiungere 1 ml di reagente Etichettatura proliferazione cellulare (BrdU) per ml di mezzo di coltura cellulare (1-1000 diluizione) 1 ora prima della raccolta. Il periodo di etichettatura potrebbe essere necessario allungare di cellule in crescita più lenta. Alle cellule raccolto, terreno di coltura aspirare e lavare accuratamente con tampone fosfato (PBS). Ripetere l'operazione per rimuovere completamente le tracce di terreno. Lavare rapidamente le culture per la terza volta con PBS contenente 3mM EDTA ed aspirare accuratamente. Aggiungere un piccolo volume di PBS contenente 3mM EDTA per ogni piatto, 0,5 ml per un piatto di 6 centimetri è l'ideale. Incubare a 22 ° C per circa 5 minuti per staccare le cellule. Trasferire in un tubo da 15 ml. Cellule centrifugare a 500 xg per 5 minuti per far sedimentare, rimuovere il surnatante, e risospendere completamente in 100 ml di PBS. Fissare le cellule con l'aggiunta di 5 mL di EtOH 95%, goccia a goccia, mentre vortex. A questo punto, le cellule possono essere conservati a 4 ° C per almeno unmese. 2. Denaturazione e colorazione di BrdU e del DNA Centrifugare le cellule a 500 xg per 5 minuti alle cellule precipitato ed eliminare l'95% EtOH. Risospendere in 1 ml di HCl 2N e 0,5% Tx-100 con l'aggiunta in modo goccia a goccia mentre vortex. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Centrifugare come prima nella sezione 2.1 e aspirare il surnatante con cura poiché le cellule formano un pellet molto sciolto in questa fase. Delicatamente risospendere in 1 ml di 0.1M NaB 4 O 7 (pH 8,5) e incubate per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Cellule pellet come sopra nella sezione 2.1 e risospendere in 0,5 mL di soluzione di anticorpi (PBS contenente BSA 1% e 0,2% di Tween-20) con il mouse anticorpi anti-BrdU diluito 1 a 50. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Celle a pellet di nuovo e risospendere in 50 mL di soluzione contenente anticorpi di coniglio anti-topo anticorpi secondari coniugati con FITC diluito 1 a 25. Incubare per 30 minutida banco e proteggere dalla luce. Centrifugare le cellule un'ultima volta e risospendere in 0,5 ml di ioduro di propidio e RNasi soluzione (PI-RNAse soluzione PBS con BSA 1%, 10 mg / mL di ioduro di propidio, 0,25 mg / ml RNasi A) e incubare al buio a 37 ° C per 30 minuti. In alternativa l'RNA può essere digerito notte a 4 ° C al buio. Passare la soluzione attraverso un colino per eliminare aggregati di cellule e raccogliere singole cellule in un apposito tubo per l'assorbimento del campione sul citofluorimetro. Anche in questo caso, i campioni devono essere protetti dall'esposizione diretta alla luce. 3. Analisi mediante citometria di flusso Le cellule devono essere analizzati con un citometro a flusso standard che è in grado di discriminare doppiette (due celle che passano attraverso la cella di flusso come uno) con capacità di rilevamento appropriati per FITC e ioduro di propidio. Singole cellule possono essere rilevati in questa applicazione citometria a flusso di gating per gli eventi sulla base di scatter in avanti e laterale pop dispersionementari, e utilizzando le proprietà di colorazione del DNA con ioduro di propidio. L'aspetto di un complotto doppietto punto discriminante varia tra citofluorimetri e si basa sulle proprietà colorazione ioduro di propidio, vedere il locale impianto di citometria a flusso per un consiglio su come impostare un discriminatore doppietto nella vostra analisi. In generale, in una popolazione di cellule proliferanti in modo asincrono, le singole celle sono di solito i due picchi più abbondanti (2N e 4N DNA) nella trama doppietto discriminante e un cancello dovrebbe essere disegnato intorno a loro. In questo modo selezionare gli eventi singola cella che vengono utilizzati per tutte le successive analisi di seguito. Il primo campione da analizzare deve essere una cultura in modo asincrono proliferanti che funge da controllo positivo per la colorazione e citofluorimetro set-up. Regolare la sensibilità di fotomoltiplicatori per la colorazione ioduro di propidio in modo tale che i picchi 2N e 4N dalle cellule singoletto sono centrate a 200 e 400 (unità arbitrarie) sul asse X. Spesso si macchia una s abbondanteupply di queste cellule per garantire che tutti i parametri della citometria a flusso sono state opportunamente adeguata senza usare questo esempio. Questo controllo positivo è utile anche per i nuovi utenti a familiarizzare con il funzionamento della citometria a flusso. Regolare la sensibilità del tubo fotomoltiplicatore per la rilevazione FITC tale che le popolazioni G1 e G2 / M sono al di sopra di fondo. Cellule BrdU positive dovrebbero essere circa 10 volte più luminoso e l'asse Y dovrebbe essere visualizzato come una scala logaritmica. A volte è utile inserire un controllo negativo per la colorazione BrdU (sostituendo l'anti-BrdU con anticorpi non specifici IgG al punto 2.3) per distinguere chiaramente le cellule colorate positivamente. Regolare la compensazione tra ioduro di propidio e FITC tale che i singoli eventi acquisiti dal modulo citofluorimetro un arco a forma di ferro di cavallo da G1 in basso a sinistra fino alla fase S e giù in basso a destra per G2 / M. Si prega di consultare il seguente riferimento per una più approfondita displayscussione dei principi e l'uso di citometria a flusso e riferimenti lì per applicazioni specifiche 2. 4. Analisi dei dati 5 000 a 10 000 eventi singola cella con la gamma di contenuto desiderato DNA devono essere raccolti per ogni campione al fine di avere fiducia che la popolazione di cellule in coltura sono stati completamente campionati. Una volta che le cellule sono stati misurati per ioduro di propidio e contenuti BrdU cui hanno bisogno per essere assegnati alle fasi G1, S o G2 / M. Fare tracciando cancelli intorno alle due popolazioni BrdU negativa centrata a 200 e 400 (G1 e G2 / M, rispettivamente). Tutto ciò che sopra queste caselle devono essere inclusi in una sola porta che misura fase S (Fig. 1A). La percentuale di cellule in ogni porta rappresenta il numero relativo di cellule in G1, S e G2 / M (Fig. 1B). 5. Protocollo alternativo per l'analisi del ciclo cellulare in una popolazione mista di cellule Questo protocollo alternativo èpiù utile quando la trasfezione di vettori di espressione di routine si traduce in una bassa percentuale di cellule che esprimono il prodotto del gene di interesse, o quando il trattamento della droga per selezionare una popolazione pura di cellule non è praticabile. Ciò si traduce in una percentuale relativamente piccola di cellule di interesse contaminazione con una grande popolazione di cellule untransduced. In questo caso, co-trasfezione plasmidi che esprimono il gene o shRNA di interesse lungo con un plasmide che esprime un marker per la rilevazione di cellule transfettate mediante citometria di flusso, come una membrana ancorata GFP 3 o uno straniero marcatore di superficie delle cellule, come CD19 4 o CD20 5. Ai fini di questo protocollo useremo CD20 colorazione a titolo di esempio, tuttavia, la colorazione di CD19 è sostanzialmente identica. Nel caso di transfezione con CD20, non c'è bisogno di etichettare BrdU, semplicemente celle immagazzinano come descritto nei passaggi 1,2-1,5 sopra e colorare con l'aggiunta di 20 l FITC coniugato anti-CD20 anticorpi alle cellule su ice per 20 minuti al buio. Fissare le cellule, come descritto in 1,6 passo. Le cellule possono ancora essere conservati per almeno un mese a 4 ° C al buio. Per il rilevamento di GFP, omettere la colorazione degli anticorpi da questo passaggio e fissare e conservare le cellule come descritto. Reidratare le cellule di rivestimento nella centrifuga a 500 xg per 5 minuti e risospendere in 5 ml di PBS contenente l'1% BSA. Re-agglomerare le cellule a 500 xg per 5 minuti e risospendere le cellule in 0,5 ml di soluzione di ioduro di propidio e RNase come descritto sopra nella sezione 2.5. Continua a seguire le istruzioni di preparazione delle cellule in 2,6 e analisi le istruzioni ai punti 3.1 e 3.2. Regolare la sensibilità del tubo fotomoltiplicatore per la rilevazione FITC tale che le cellule non colorate sono al di sopra di fondo. Idealmente, le cellule CD20-positive FITC sarà 10X a 100X più intensamente colorato di sfondo e l'asse Y di questa trama dovrebbe essere visualizzato come una scala logaritmica (fig. 2A). CD20 cellule positive che sono 10 volte più luminosa rispetto backgtondo (e con colorazione ioduro di propidio tra 200 e 400) dovrebbero essere selezionati per la visualizzazione in un ioduro di propidio contro la conta delle cellule istogramma come mostrato in fig. 2C. Per le linee di cellule che esprimono i marcatori che sono prontamente colorati vivacemente (es. 10X a 100X sopra di fondo) la CD20 positivo, cut-off dovrebbe essere fissato a sfondo 10X. Inclusione delle cellule colorazione più deboli aumenta la variabilità in questi esperimenti, presumibilmente perché il gene di interesse è anche debolmente espresso in queste cellule. Per le linee di cellule che solo resa debolmente macchiato CD20 positivi (cioè meno di sfondo 10X), la determinazione di un largo taglio dovrebbe essere effettuato con un controllo negativo costituito da CD20 macchiato, le cellule untransfected. Almeno 1000 CD20 eventi positivi devono essere raccolti per ogni campione. Esperimenti con meno di 1000 eventi produrranno elevata variabilità. I pacchetti software come ModFit LT (Verity Software), AV Multi Cycle (Phoenix Sistemi di flusso) e di flusso Jo (Albero Star) utilizzare stime matematiche delle popolazioni G1, S e G2 / M che contribuiscono alla forma della curva di istogrammi come quello mostrato in fig. 2B e C. 6. Rappresentante dei risultati: Forniamo tre esempi di analisi sperimentale del ciclo cellulare utilizzando il nostro approccio. Il primo utilizza l'espressione retrovirali del dipendente p27Kip1 inibitore della chinasi ciclina in fibroblasti embrionali di topo. Ventiquattro ore dopo la selezione dei farmaci per l'infezione virale era completa, le cellule sono state impulso etichettati con BrdU per un'ora. In questo esperimento espressione ectopica dell'inibitore è usato per arrestare la proliferazione delle cellule (Fig. 3A e B). Come mostrato in fig. 3B poco BrdU eventi positivi sono evidenti nella fase S porta in risposta a p27. Allo stesso modo, la percentuale di cellule in fase S per cellule che esprimono p27 è piuttosto basso come diagramed in fig. 3C. Questo tipo di analisi è stato molto efficace nel caratterizzare i difetti controllo del ciclo cellulare nelle cellule derivate da ceppi diversi di gene mirati topi 6, 7, 8. Nel secondo esperimento, non trasformato cellule epiteliali mammarie (MCF10A) sono stati trattati con la citochina crescita inibitori, beta fattore di crescita trasformante uno (TGF-β1) per 24 ore. Le cellule sono state etichettate con BrdU per quattro ore immediatamente prima della raccolta. Come mostrato in fig. 4 sull'etichettatura BrdU nelle cellule in fase S è notevolmente diminuita del TGF-β1 segnalazione, la specificità del nostro colorazione è anche convalidato con un controllo IgG negativo (Fig. 4C). La quantificazione delle diverse fasi del ciclo cellulare conferma che TGF-β1 in primo luogo inibisce la proliferazione nella fase G1 del ciclo cellulare, portando a un accumulo in questa fase. Nel nostro ultimo esempio, pRB carente SaOS-2 cellule sono transfettate con un vettore CMV-CD20 espressione e sia CMV-RB o CMV-β-Gal come controllo. Tre giorni dopo la transfezione le cellule sono state raccolte, macchiato, e fissa. Analisi di citometria a flusso di queste cellules è mostrato in fig. 5. Questo dimostra la distribuzione del ciclo cellulare delle cellule di controllo negativo transfettate (Fig. 5A) in confronto con la seguente distribuzione 72 ore di espressione pRB (Fig. 5B). A seguito di curve fitting da un software Cicli multipli, un confronto diretto della proporzione delle fasi del ciclo cellulare è mostrato in fig. 5C. Questo rivela l'accumulo di cellule in G1 seguente espressione pRB e l'impoverimento relativo di cellule dalle fasi S e G2 / M. Abbiamo usato variazioni su questo test per sondare i meccanismi di arresto G1 ampiamente 9, 10, 11, 12, 13. Questi esempi dimostrano come controllo del ciclo cellulare può essere misurata in risposta a una varietà di stimoli o di manipolazioni delle cellule. Questo approccio può quindi essere adattato a molte applicazioni che richiedono la misura della posizione del ciclo cellulare negli esperimenti di tipo culturale. Figura 1. Quantitzione delle fasi del ciclo cellulare mediante ioduro di propidio combinato e colorazione BrdU (PI-BrdU). (A) Questo pannello mostra tre citometria a flusso dimensionale di ioduro di propidio e cellule colorate BrdU. Si noti che le cellule con contenuto di DNA 2N e 4N sono centrate sui 200 e 400 segni sulla asse X scala per intensità della colorazione ioduro di propidio. Intensità di colorazione BrdU viene misurata su una scala logaritmica per l'asse Y. Si noti la posizione delle porte utilizzate per quantificare le cellule nelle fasi G1, S e G2 / M del ciclo cellulare. (B) la percentuale relativa di cellule in ciascuna delle porte G1, S e G2 / M di A sono riportati su questo grafico. Figura 2. Quantificazione delle fasi del ciclo cellulare nelle cellule selezionate con ioduro di propidio e la superficie delle cellule CD20 marcatore. (A) Questo pannello mostra ioduro di propidio e CD20 colorazione per una miscela di cellule, alcune delle quali ectopica esprimere CD20 e pRB. Si noti che le cellule con2N e 4N del DNA (le popolazioni più abbondanti) sono centrate sui 200 e 400 segni sulla asse X. La posizione del + CD20 cancello seleziona le celle che sono macchiati di almeno 10 volte più luminosa di fondo. (B) Un grafico di conta delle cellule contro colorazione ioduro di propidio è indicato per le cellule CD20 negativi in ​​un pannello che si moltiplicano in modo asincrono. (C) Un grafico simile a quello mostrato per le cellule CD20 positive dal pannello di A che sono state indotte ad arrestare con l'espressione pRB e contengono cellule con contenuto di DNA soprattutto 2N. Questo dimostra che un arrestato sotto-popolazione può essere distinto da altre cellule in questa cultura utilizzando questa tecnica di colorazione. Figura 3. Inibizione della proliferazione cellulare da p27Kip1. (A) PI-BrdU analisi è utilizzato per misurare le fasi del ciclo cellulare in una popolazione in modo asincrono proliferazione di cellule che sono state trasdotte con un vuoto vecto pBABE retroviralir. (B) Una simile analisi di cellule trasdotte con pBABE-p27. Si noti l'assenza di cellule nella fase S e la maggiore intensità degli eventi in G1 e G2 / M cancelli. (C) La determinazione quantitativa di cellule nelle varie fasi del ciclo cellulare in modo asincrono proliferazione di controllo e cellule che esprimono p27. Figura 4. Inibizione della proliferazione cellulare da TGF-β1 (A) PI-BrdU analisi di cellule proliferanti in modo asincrono MCF10A. (B) Analisi delle cellule trattate con 100 pM di TGF-β1 per 24 ore. Notare l'accumulo di cellule principalmente nella fase G1 del ciclo cellulare. (C) Validazione di colorazione BrdU sostituendo il anti-BrdU con un anticorpo primario non specifico controllo IgG nelle cellule proliferanti in modo asincrono. (D) quantificazione grafica delle fasi rispettivi ciclo cellulare da A e B. <br/> Figura 5. Inibizione della proliferazione cellulare da pRB. (A) rispetto al conteggio delle cellule colorazione ioduro di propidio di CD20 e ß-gal cellule transfettate viene mostrato. Si tratta di un controllo importante come la trasfezione può parzialmente sincronizzare le cellule, rendendo la popolazione untransfected (CD20 – cellule) come un controllo inadeguato per la trasfezione sub-popolazione. Cellule trasfettate devono essere comparati con le altre cellule analogamente transfettate. (B) conta cellulare contro grafico ioduro di propidio di CD20 e pRB transfettate cellule. Si noti la presenza quasi esclusiva di un picco 2N. (C) Rappresentazione grafica di proporzioni ciclo cellulare fase determinata da A e B con metodi curva di raccordo nel software Cicli multipli.