ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

1. תיוג ותיקון של תאים הוסף 1 μL של מגיב הפצת סימון תא (BrdU) לכל מ"ל של תרבית תאים בינוניים שעה 1 (1-1000 דילול) לפני הקציר. תקופת תיוג ייתכן שיהיה צורך התארך בתאי גידול איטי יותר. כדי תאים הקציר, בינוני תרבות לשאוב ולשטוף ביסודיות עם פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). חזור אל ביסודיות להסיר עקבות של המדיום. לשטוף במהירות תרבויות בפעם השלישית עם PBS המכיל EDTA 3mm ו לשאוב ביסודיות. הוספת נפח קטן של PBS המכיל EDTA 3mm על כל מנה, 0.5 מ"ל למנה 6 ס"מ הוא אידיאלי. לדגור על 22 מעלות צלזיוס למשך כ 5 דקות לנתק את התאים. העברה צינור חרוטי 15 מ"ל. תאים צנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות עד גלולה, להסיר supernatant ו resuspend ביסודיות μL 100 של PBS. תקן תאים על ידי הוספת 5 מ"ל של 95% EtOH, dropwise, בעוד vortexing. בשלב זה, התאים ניתן לאחסן 4 מעלות לפחותחודש. 2. Denaturing והכתים של BrdU ו-DNA צנטריפוגה תאים ב XG 500 במשך 5 דקות לתאי גלולה ולהסיר EtOH 95%. Resuspend ב 1 מ"ל של HCl ו – 2N 0.5% Tx-100 על ידי הוספת בצורה טיפה חכם בעוד vortexing. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. צנטריפוגה כמו קודם בסעיף 2.1 ובזהירות לשאוב supernatant מאז התאים בצורה כדורית רופף מאוד בשלב הזה. Resuspend בעדינות 1 מ"ל של 0.1M NAB 4 O 7 (pH 8.5) ו מודגרות במשך לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר. תאים גלולה כאמור לעיל בסעיף 2.1 ו resuspend ב 0.5 מ"ל של תמיסת נוגדן (PBS המכיל 1% ו -0.2% BSA Tween-20) עם נוגדנים עכבר אנטי BrdU בדילול 1-50. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. תאים גלולה שוב resuspend ב 50 מ"ל של תמיסת נוגדן המכיל אנטי עכבר ארנב נוגדנים משני מצומדות כדי FITC בדילול 1-25. דגירה במשך 30 דקות עלbenchtop ולהגן מפני אור. תאים צנטריפוגה זמן resuspend סופית ב 0.5 מ"ל של יודיד propidium ו RNase פתרון (PI-RNAse פתרון, PBS עם BSA 1%, 10 מ"ג / מ"ל ​​יודיד propidium, 0.25 מ"ג / מ"ל ​​RNase A) דגירה בחושך על 37 ° C במשך 30 דקות. לחילופין ניתן לעכל RNA לילה ב 4 ° C בחושך. Pass פתרון דרך מסננת תא להסיר אגרגטים לאסוף תאים בודדים בתוך צינור מתאים ספיגת מדגם על cytometer תזרים שלך. שוב, דוגמאות צריך להיות מוגן מפני חשיפה ישירה לאור. 3. ניתוח על פי זרימת cytometry תאים צריך להיות מנותח על ידי cytometer זרימה רגיל, כי הוא מסוגל להפלות כפילויות (שני תאים שעוברים דרך התא זרימה כאחד) עם יכולת זיהוי מתאים יודיד propidium ו FITC. תאים בודדים ניתן לאתר בבקשה זו cytometry זרימת ידי gating לאירועים מבוסס על פיזור קדימה הצד פופ פיזורulations, ועל ידי שימוש מכתים את המאפיינים של ה-DNA על ידי יודיד propidium. הופעתו של העלילה נקודה כפיל מפלה משתנה בין cytometers תזרים והוא מסתמך על המאפיינים מכתים propidium יודיד, ראה cytometry במתקן המקומי תזרים עצה על הקמת מאבחן כפיל בניתוח שלך. באופן כללי, באוכלוסייה באופן אסינכרוני מתרבים תאים, תאים בודדים הם בדרך כלל שתי פסגות הנפוץ ביותר (2N ו 4N DNA) בעלילה להפלות כפיל ושער צריך להיות נמשך סביבם. זה יבחר את אירועי תא יחיד המשמשים לניתוח כל הבאים להלן. המדגם הראשון לנתח צריכה להיות תרבות אסינכרוני מתרבים המשמש כביקורת חיובית מכתים ו cytometer תזרים הגדרת. התאם את הרגישות של צינורות מכפיל עבור מכתים יודיד propidium כזה פסגות 2N ו 4N מתאי גופיה מרוכזים ב 200 ו 400 (יחידות שרירותיות) על ציר ה-X. לעתים קרובות אנו כתם של שפעupply של תאים אלה על מנת להבטיח כי כל הפרמטרים של זרימת cytometer הותאמו כראוי ללא שימוש עד מדגם זה. שליטה זו חיובית הוא גם מועיל עבור משתמשים חדשים להכיר טוב יותר עם המבצע של cytometer את הזרימה. התאם את הרגישות של הצינור מכפיל לגילוי FITC כך אוכלוסיות G1 ו – G2 / M הם מעל הרקע. תאים BrdU חיובי צריך להיות בערך 10 פעמים בהירים ואת ציר Y צריך להיות מוצג סולם לוגריתמי. לפעמים זה מועיל לכלול שליטה שלילי מכתים BrdU (על ידי החלפת אנטי BrdU נוגדנים עם הלא ספציפית IgG בשלב 2.3 לעיל) כדי להבחין בבירור תאים מוכתם חיובי. התאם בין פיצוי יודיד propidium ו FITC כזה נתפס על ידי אחד האירועים בצורת תזרים cytometer נעל סוס בצורת קשת מ-G1 ב התחתון השמאלי עד לשלב ו-S לתוך הימנית התחתונה עבור G2 / M. אנא ראה את הפניה הבאה במשך יותר לעומק דיסcussion של עקרונות ושימוש cytometry זרימה והפניות שם עבור יישומים ספציפיים 2. 4. ניתוח נתונים 5 0-100 000 אירועים תא בודד עם מגוון התוכן הרצוי DNA יש לאסוף עבור כל דגימה על מנת להיות בטוחים כי אוכלוסיית התאים בתרבית כבר שנדגמו ביסודיות. ברגע תאים נמדדו עבור יודיד propidium ותוכן BrdU הם צריכים להקצות את שלבי G1, S, או G2 / M. לעשות זאת על ידי ציור השערים סביב שתי האוכלוסיות BrdU שלילי מרוכז ב 200 ו 400 (G1 ו – G2 / M בהתאמה). הכל מעל תיבות אלה יש לכלול שער בודד אשר מודד S-שלב (איור 1A). אחוז התאים שער כל אחד מייצג את המספר היחסי של תאים G1, S, G2 / M (איור 1B). 5. פרוטוקול חלופי לניתוח של מחזור התא באוכלוסייה מעורבת של תאים זה פרוטוקול חלופיתמועיל ביותר כאשר transfection של וקטורים ביטוי שגרתי תוצאות באחוז נמוך של התאים המבטאים את הגן המוצר של עניין, או כאשר הטיפול התרופתי כדי לבחור אוכלוסייה טהורה של התאים אינו מעשי. התוצאה היא שיעור קטן יחסית של תאים עניין להיות מזוהם עם אוכלוסייה גדולה של untransduced תאים. במקרה זה, שיתוף transfect פלסמידים להביע הגן שלך או shRNA עניין יחד עם הפלסמיד המבטא סמן לזיהוי תאים transfected ידי cytometry זרימה, כגון קרום מעוגן GFP 3, או סמן זרים פני התא כגון CD19 4 או CD20 5. למטרות פרוטוקול זה נשתמש CD20 מכתים כדוגמה, לעומת זאת, מכתים עבור CD19 זהה במהותו. במקרה של transfection עם CD20, אין צורך לתייג BrdU, פשוט קציר תאים כמתואר צעדים 1.2-1.5 מעל כתם על ידי הוספת 20 μL FITC מצומדות אנטי CD20 נוגדנים לתאי על ice למשך 20 דקות בחושך. תקן תאים כמתואר 1.6 צעד. תאים יכולים שוב להיות מאוחסן במשך חודש לפחות 4 ° C בחושך. עבור גילוי ה-GFP, להשמיט את מכתים נוגדן משלב זה ולתקן ולאחסן התאים כמתואר. מימה מחדש את התאים על ידי pelleting בצנטריפוגה ב XG 500 במשך 5 דקות ו resuspending ב 5 מ"ל של PBS BSA המכיל 1%. Re-גלולה התאים ב XG 500 במשך 5 דקות ותאי resuspend ב 0.5 מ"ל של יודיד propidium פתרון RNase כמתואר לעיל בסעיף 2.5. המשך לעקוב אחר הוראות הכנה תא 2.6 וניתוח ההוראות 3.1 ו 3.2. התאם את הרגישות של הצינור מכפיל לגילוי FITC כך התאים בלא כתם הם מעל הרקע. באופן אידיאלי, CD20-FITC תאים חיובי יהיה 10X עד 100x יותר צבעונית מאוד מאשר הרקע ואת ציר Y של העלילה הזאת אמורה להיות מוצגת כמו סולם לוגריתמי (איור 2A). תאים CD20 חיובי, כי הם בהירים 10X מ backgעגול (עם מכתים יודיד propidium בין 200 ל 400) יש לבחור לתצוגה יודיד propidium לעומת ספירת תאים היסטוגרמה, כפי שמוצג באיור. 2C. עבור שורות תאים המבטאים סמנים כי הם מוכתמות בקלות במאור פנים (10X כלומר, עד 100x לעיל רקע) CD20 חיובי חתוכים צריך להיות מוגדר על רקע 10X. הכללה של תאים מכתים החלש מגביר את השתנות בניסויים אלו, יש להניח כי את הגן של עניין הוא גם הביע חלושות בתאים אלה. עבור שורות תאים שרק תשואה מוכתם חלושות CD20 חיוביות (כלומר, פחות רקע 10X), קביעת חתך את צריכה להיעשות באמצעות שליטה שלילי בהיקף של CD20, תאים מוכתם untransfected. לפחות 1000 CD20 אירועים חיוביים יש לאסוף עבור כל דגימה. ניסויים עם פחות אירועים כי 1000 יהיה לייצר שונות גבוהה. חבילות תוכנה כגון ModFit LT (וריטי תוכנה), מחזור AV Multi (פיניקס מערכות זרימה), וכן תזרים ג'ו (עץ הכוכבים) להשתמש באומדנים מתמטי שלה-G1, S, G2 / M האוכלוסיות שתורמות הצורה של עקומת ב היסטוגרמות כמו אלה באיור. 2B ו-C 6. נציג תוצאות: אנו מספקים שלוש דוגמאות של ניתוחים ניסיוניים מחזור התא תוך שימוש בגישות שלנו. הראשונה משתמשת בביטוי retroviral של p27KIP1 מעכבי קינאז תלוי cyclin ב fibroblasts העכבר עובריים. עשרים וארבע שעות לאחר בחירת התרופה עבור זיהום ויראלי היה מלא, התאים היו הדופק שכותרתו עם BrdU במשך שעה אחת. בניסוי זה ביטוי אקטופי של מעכב משמש לעצור התפשטות של התאים (איור 3A ו-B). כפי שמוצג באיור. 3B מעט אירועים BrdU חיוביות ניכרות בשער S-השלב בתגובה p27. כמו כן, אחוז התאים בשלב S-של p27 בתאים לבטא נמוכה למדי כמו diagramed באיור. 3C. סוג זה של ניתוח היה יעיל מאוד המאפיינת את מחזור התא בקרת פגמים בתאים שמקורם זנים שונים של gENE במיקוד עכברים 6, 7, 8. בניסוי השני, untransformed בתאי אפיתל החלב (MCF10A) טופלו ציטוקינים הצמיחה מעכבות, הפיכת גורם הגדילה בטא אחת (TGF-β1) למשך 24 שעות. תאים תויגו עם BrdU במשך ארבע שעות ממש לפני הקציר. כפי שמוצג באיור. 4 תיוג BrdU ב-S שלב התאים היא פחתה במידה רבה על ידי TGF-β1 איתות, סגוליות של מכתים שלנו הוא תוקף גם עם פקד IgG שלילי (איור 4C). כימות של השלבים השונים של מחזור התא מאשרת כי TGF-β1 בעיקר מעכב התפשטות בשלב G1 של מחזור התא, מה שמוביל להצטברות בשלב זה. בדוגמה האחרונה, PRB לקוי SaOS-2 תאים transfected עם וקטור CMV-CD20 הביטוי או CMV-RB או CMV-β-Gal כביקורת. שלושה ימים לאחר transfection התאים נקצרו, מוכתמים, ואת קבוע. Cytometry זרימה ניתוח של התא אלהזה מוצג באיור. 5. זה מדגים את מחזור התא חלוקת תאים שליטה שלילי transfected (איור 5 א) בהשוואה ההפצה הבאה 72 שעות הביטוי PRB (איור 5 ב). בעקבות הולם עקומת ידי תוכנה מחזור רב, השוואה ישירה של היחס של שלבי מחזור התא מוצג באיור. 5 ג. זו חושפת את הצטברות של תאים בביטוי G1 PRB הבאים דלדול יחסי של תאים בשלבים S ו-G2 / M. השתמשנו וריאציות על assay זה לחקור מנגנונים G1 מעצר בהרחבה 9, 10, 11, 12, 13. דוגמאות אלה מדגימים כיצד לשלוט במחזור התא ניתן למדוד תגובה למגוון של גירויים או מניפולציות התא. גישה זו יכולה אפוא להיות מותאם יישומים רבים הדורשים מדידה של מיקום התא מחזור בניסויים סוג התרבות. באיור 1. Quantitation של שלבי מחזור התא על ידי יודיד propidium בשילוב מכתים BrdU (PI-BrdU). (א) לוח זה מציג שלושה cytometry זרימה ממדי של יודיד propidium ותאי BrdU מוכתם. שים לב כי ה-DNA בתאים עם תוכן 2N ו 4N מרוכזים על פני 200 ו – 400 סימנים על סולם ציר ה-X על עוצמת מכתים propidium יודיד. עוצמת BrdU מכתים נמדדת על סולם לוגריתמי על ציר ה-Y. הערה המיקום של שערים המשמשים לכמת תאים בשלבים G1, S, G2 / M של מחזור התא. (ב) שיעור היחסי של תאים בכל אחד השערים G1, S, G2 / M מ מוצגים על הגרף הזה. באיור 2. Quantitation של שלבי מחזור התא בתאים שנבחרו באמצעות יודיד propidium ואת שטח פני התא סמן CD20. (א) לוח זה מציג את יודיד propidium ו CD20 מכתים עבור תערובת של תאים, שחלקם ectopically להביע CD20 ו PRB. שים לב כי תאים עם2N ו-DNA 4N (האוכלוסיות הנפוץ ביותר) מרוכזים על פני 200 ו – 400 סימנים על ציר ה-X. העמדה של + CD20 שער בוחר תאים מוכתמות לפחות 10X בהירים יותר רקע. (ב) גרף של ספירת תאים לעומת מכתים יודיד propidium מוצג עבור CD20 בתאי שלילי בפאנל כי הם מתרבים באופן אסינכרוני. (ג) גרף דומה מוצג עבור CD20 בתאי חיובי מהלוח כי כבר המושרה לעצור בהבעת PRB ומכילים תאים עם תוכן ה-DNA בעיקר 2N. זה מוכיח כי נעצרו תת אוכלוסייה ניתן להבחין בין תאים אחרים בתרבות זו באמצעות טכניקה זו מכתים. באיור 3. עיכוב של התפשטות תאים על ידי p27KIP1. (א) PI-BrdU הניתוח משמש כדי למדוד את שלבי מחזור התא אוכלוסייה אסינכרונית של תאים מתרבים שהיו transduced עם vecto ריק retroviral pBABEr. (ב) ניתוח דומה של תאים transduced עם pBABE-p27. הערה העדרו של תאים בשלב-S ואת העוצמה גדולה יותר של האירועים G1 ו – G2 / M שערים. (ג) quantitation של תאים בשלבים השונים של מחזור התא באופן אסינכרוני מתרבים מלאה p27 בתאים לבטא. איור 4. עיכוב של התפשטות תאים על ידי TGF-β1 (א) PI-BrdU ניתוח אסינכרוני מתרבים תאים MCF10A. (ב) ניתוח של תאים שטופלו PM 100 של TGF-β1 למשך 24 שעות. הערה הצטברות של תאים בעיקר בשלב G1 של מחזור התא. (ג) אימות של מכתים BrdU ידי החלפת נוגדן אנטי BrdU ראשוני עם שלט IgG הלא ספציפית בתאים מתרבים באופן אסינכרוני. (ד) quantitation גרפי של השלבים השונים במחזור התא A ו-B <br/> איור 5. עיכוב של התפשטות תאים על ידי PRB. (א) ספירת תאים לעומת מכתים יודיד propidium של CD20 ותאי transfected גל SS-מוצג. זהו פקד חשוב transfection יכול לסנכרן חלקית תאים, עיבוד האוכלוסייה untransfected (CD20 – תאים) כמו שליטה בלתי הולמת עבור transfected תת אוכלוסיה. תאים transfected צריך להיות, לעומת תאים transfected באנלוגיה אחרים. (ב) מונה Cell לעומת גרף יודיד propidium של CD20 ו PRB transfected תאים. הערה נוכחות כמעט בלעדית של לשיא 2N. (ג) ייצוג גרפי של מחזור התא בשלב הפרופורציות נקבע מ B ו בשיטות עקומת הולם תוכנה מחזור רב.