Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

1. L'étiquetage et la fixation des cellules Ajouter 1 ul de réactif de marquage prolifération cellulaire (BrdU) par ml de milieu de culture cellulaire (1 à 1000 de dilution) 1 heure avant la récolte. La période d'étiquetage peut être nécessaire de rallongée pour plus lent des cellules en croissance. Pour les cellules de la récolte, un milieu de culture, aspirer et laver soigneusement avec du tampon phosphate salin (PBS). Répéter pour bien enlever les traces de milieu. Lavez rapidement les cultures une troisième fois avec du PBS contenant 3 mM EDTA et aspirer à fond. Ajouter un petit volume de PBS contenant 3 mM EDTA à chaque plat, 0,5 ml pour un plat de 6 cm est idéale. Incuber à 22 ° C pendant environ 5 minutes pour détacher les cellules. Transférer dans un tube de 15 ml conique. Centrifuger les cellules à 500 xg pendant 5 minutes pour obtenir un culot, enlever le surnageant et remettre soigneusement dans 100 ul de PBS. Fixer les cellules en ajoutant 5 ml d'EtOH à 95%, goutte à goutte, tout en vortex. À cette étape, les cellules peuvent être conservés à 4 ° C pendant au moins unemois. 2. La dénaturation et la coloration de BrdU et l'ADN Centrifuger les cellules à 500 xg pendant 5 minutes pour sédimenter les cellules et enlever EtOH 95%. Remettre en suspension dans 1 ml de HCl 2N et 0,5% Tx-100 par l'ajout d'une manière goutte à goutte tout en vortex. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Centrifuger comme avant dans la section 2.1 et aspirer délicatement le surnageant puisque les cellules forment un très lâche granules à cette étape. Doucement remettre en suspension dans 1 mL de 0,1 M NaB 4 O 7 (pH 8,5) et incubées pendant au moins 30 minutes à température ambiante. Pellet cellules comme ci-dessus dans la section 2.1 et remettre en suspension dans 0,5 ml de solution d'anticorps (PBS contenant 1% et BSA 0,2% de Tween-20) avec des anticorps de souris anti-BrdU dilué de 1 à 50. Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Cellules Pellet à nouveau et remettre en suspension dans 50 ml de solution contenant des anticorps de lapin anti-souris des anticorps secondaire conjugué au FITC dilué 1 à 25. Incuber pendant 30 minutes surpaillasse et de protéger de la lumière. Centrifuger les cellules une dernière fois et remettre en suspension dans 0,5 ml d'iodure de propidium et RNase solution (PI-RNAse solution PBS avec 1% de BSA, 10 mg / mL d'iodure de propidium, 0,25 mg / mL de RNase A) et incuber à l'obscurité à 37 ° C pendant 30 minutes. Alternativement ARN peut être digéré une nuit à 4 ° C dans l'obscurité. Passe solution à travers une passoire pour enlever les agrégats de cellules et de recueillir des cellules individuelles dans un tube approprié pour l'absorption de l'échantillon sur votre cytomètre en flux. Encore une fois, les échantillons doivent être protégés de toute exposition directe à la lumière. 3. Analyse par cytométrie en flux Les cellules doivent être analysés par un cytomètre en flux standard qui est capable de discriminer des doublets (deux cellules qui passent à travers la cellule de flux comme l'une) avec une capacité de détection approprié pour l'iodure de propidium et FITC. Les cellules individuelles peuvent être détectés dans cette demande de la cytométrie de flux par gating pour des événements basés sur dispersent vers l'avant et côté pop de dispersionulations, et en utilisant les propriétés de coloration de l'ADN par l'iodure de propidium. L'apparition d'un nuage de points discriminant doublet varie entre cytomètres de flux et s'appuie sur les propriétés de propidium coloration iodure, voir votre installation locale de cytométrie en flux pour des conseils sur la mise en place d'un discriminateur doublet dans votre analyse. En général, dans une population asynchrone prolifération des cellules, des cellules simples sont habituellement les deux sommets les plus abondants (2N et 4N ADN) dans le complot doublet discriminant et une porte devrait être établi autour d'eux. Cela permet de sélectionner des événements cellule unique qui sont utilisés pour toutes les analyses ultérieures ci-dessous. Le premier échantillon à analyser doit être une culture asynchrone proliférant qui sert de contrôle positif pour la coloration et cytomètre en flux set-up. Réglez la sensibilité de tubes photomultiplicateurs pour la coloration de l'iodure de propidium tels que les pics 2N et 4N partir de cellules de singulet sont centrées à 200 et 400 (unités arbitraires) sur l'axe X. Nous avons souvent une tache s abondanteupply de ces cellules pour s'assurer que tous les paramètres du cytomètre en flux ont été ajustés de manière appropriée sans utiliser cet échantillon. Ce contrôle positif est également utile pour les nouveaux utilisateurs de se familiariser avec le fonctionnement du cytomètre de flux. Réglez la sensibilité du tube photomultiplicateur pour la détection de FITC tels que les populations G1 et G2 / M sont au-dessus de fond. Cellules BrdU positives devraient être environ 10 fois plus lumineux et l'axe Y doit être affichée comme une échelle logarithmique. Il est parfois utile d'inclure un contrôle négatif pour la coloration BrdU (en remplaçant les anticorps anti-BrdU avec des non-IgG spécifiques à l'étape 2.3 ci-dessus) afin de distinguer clairement les cellules colorées positivement. Ajuster la compensation entre l'iodure de propidium et FITC tels que des événements simples capturé par la forme cytomètre en flux d'un arc en forme de fer à cheval à partir de G1 en bas à gauche jusqu'à la phase S et vers le bas dans le coin inférieur droit pour G2 / M. S'il vous plaît voir la référence suivante pour un plus en profondeur DISdiscussion sur les principes et l'utilisation de la cytométrie de flux et de références là dans des applications spécifiques 2. 4. L'analyse des données 5 000 à 10 000 événements cellule unique avec la gamme souhaitée du contenu en ADN devraient être recueillies pour chaque échantillon afin d'avoir confiance que la population de cellules dans la culture ont été soigneusement échantillonnés. Une fois que les cellules ont été mesurés pour l'iodure de propidium et le contenu de BrdU ils ont besoin pour être affecté à des phases G1, S ou G2 / M. Pour ce faire, le dessin des barrières autour des populations BrdU deux négatifs centré à 200 et 400 (G1 et G2 / M, respectivement). Tout au dessus de ces boîtes doivent être inclus dans une seule porte que les mesures de la phase S (fig. 1A). Le pourcentage de cellules dans chaque porte représente le nombre relatif de cellules en G1, S et G2 / M (Fig. 1B). 5. Protocole alternatif pour l'analyse du cycle cellulaire dans une population mixte de cellules Ce protocole alternatif estplus utile quand la transfection de vecteurs d'expression couramment traduit par un faible pourcentage de cellules exprimant le produit du gène d'intérêt, ou lorsque le traitement médicamenteux de sélectionner une population pure de cellules est impraticable. Il en résulte une proportion relativement faible de cellules d'intérêt étant contaminé par une grande population de cellules untransduced. Dans ce cas, la co-transfection de plasmides exprimant votre gène ou de shRNA d'intérêt avec un plasmide qui exprime un marqueur pour la détection de cellules transfectées par cytométrie en flux, comme une membrane ancrée GFP 3, ou un marqueur de cellule étrangère de surface tels que CD19 4 ou CD20 5. Aux fins du présent protocole, nous allons utiliser CD20 coloration comme un exemple, cependant, la coloration pour CD19 est essentiellement identique. Dans le cas de transfection avec le CD20, il n'est pas nécessaire d'étiqueter BrdU, les cellules de récolte simplement comme décrit dans les étapes 1.2 à 1.5 ci-dessus et les taches en ajoutant 20 uL FITC conjugué anticorps anti-CD20 sur les cellules sur les iCE pendant 20 minutes dans l'obscurité. Fixer les cellules comme décrit en 1.6 étape. Les cellules peuvent à nouveau être stocké pendant au moins un mois à 4 ° C dans l'obscurité. Pour la détection de la GFP, omettre la coloration des anticorps de cette étape et de fixer et de stocker les cellules comme décrit. Réhydrater les cellules par granulation dans la centrifugeuse à 500 xg pendant 5 minutes et remettre en suspension dans 5 ml de PBS contenant 1% de BSA. Re-granulés les cellules à 500 xg pendant 5 minutes et remettre les cellules dans 0,5 ml d'iodure de propidium et la solution de RNase comme décrit plus haut dans la section 2.5. Continuez à suivre les instructions de préparation de cellules dans 2,6 et l'analyse des instructions en 3.1 et 3.2. Réglez la sensibilité du tube photomultiplicateur pour la détection de FITC telles que cellules non colorées sont au-dessus de fond. Idéalement, CD20-FITC des cellules positives seront 10X à 100X plus intensément colorés que les antécédents et l'axe des Y de cette parcelle doit être affichée comme une échelle logarithmique (figure 2A). CD20 des cellules positives qui sont plus brillantes que les 10X backgrond (et avec coloration iodure de propidium entre 200 et 400) devraient être sélectionnés pour affichage dans un iodure de propidium par rapport numérations cellulaires histogramme, comme indiqué dans la Fig. 2C. Pour les lignées cellulaires qui expriment des marqueurs qui sont facilement tachés vives (c.-à-10X à 100X dessus du fond), le CD20 positif de coupure doit être réglé à fond 10X. L'inclusion des cellules présentant une coloration plus faible augmente la variabilité de ces expériences, sans doute parce que le gène d'intérêt est également faiblement exprimés dans ces cellules. Pour les lignées cellulaires qui ne donnent que faiblement teinté CD20 positifs (c.-à moins de fond 10X), la détermination d'une large coupe doit être faite en utilisant un témoin négatif constitué de CD20 tachés, les cellules non transfectées. Au moins 1000 CD20 événements positifs devraient être recueillies pour chaque échantillon. Les expériences avec moins que 1000 va produire des événements forte variabilité. Les logiciels tels que ModFit LT (Verity Software), cycle AV Multi (Phoenix Flow Systems), et les flux de Jo (Arbre Étoile) utilisent les estimations des mathématiquesles populations G1, S et G2 / M qui contribuent à la forme de la courbe des histogrammes tels que ceux montrés dans la Fig. 2B et C. 6. Les résultats représentatifs: Nous fournissons trois exemples d'analyses expérimentales du cycle cellulaire en utilisant nos approches. La première utilise l'expression de la cycline rétroviraux inhibiteurs de kinases dépendantes dans p27KIP1 fibroblastes embryonnaires de souris. Vingt quatre heures après la sélection des médicaments pour une infection virale a été complète, les cellules ont été étiquetés avec impulsion de BrdU pendant une heure. Dans cette expérience, l'expression ectopique de l'inhibiteur est utilisé pour arrêter la prolifération des cellules (Fig. 3A et B). Comme indiqué dans la Fig. 3B petits événements de BrdU positives sont évidentes dans la porte de la phase S en réponse à p27. De même, le pourcentage de cellules en phase S de cellules exprimant p27 est assez faible comme schématisé dans la Fig. 3C. Ce type d'analyse a été très efficace dans la caractérisation des défauts dans le contrôle du cycle cellulaire des cellules dérivées de diverses souches de gène-souris ciblées 6, 7, 8. Dans la deuxième expérience, les cellules épithéliales mammaires non transformées (MCF10A) ont été traités avec la cytokine la croissance inhibitrices, transforming growth factor beta un (TGF-β1) pendant 24 heures. Les cellules ont été marquées avec BrdU pendant quatre heures immédiatement avant la récolte. Comme indiqué dans la Fig. 4 marquage BrdU dans les cellules en phase S est fortement diminuée par le TGF-β1 de signalisation, la spécificité de notre coloration est également validé par un contrôle négatif IgG (figure 4C). Quantification des différentes phases du cycle cellulaire confirme que le TGF-β1 inhibe la prolifération surtout dans la phase G1 du cycle cellulaire, conduisant à une accumulation dans cette phase. Dans notre dernier exemple, PRB déficient cellules Saos-2 sont transfectées par un vecteur CMV-CD20 expression et soit CMV-RB ou CMV-β-Gal comme un contrôle. Trois jours après transfection, les cellules ont été récoltées, taché, et fixe. L'analyse par cytométrie de flux de ces celluless est montré dans la Fig. 5. Cela démontre la distribution du cycle cellulaire des cellules transfectées de contrôle négatif (Fig. 5A) en comparaison avec la répartition suivante 72 heures d'expression pRB (Fig. 5B). Après ajustement de courbe par un logiciel de cycle pluriannuel, une comparaison directe de la proportion des phases du cycle cellulaire est montré dans la Fig. 5C. Cela révèle l'accumulation de cellules en G1 pRB expression suivante et l'épuisement relatif de cellules à partir des phases S et G2 / M. Nous avons utilisé des variations sur ce test pour sonder les mécanismes d'arrêt G1 abondamment 9, 10, 11, 12, 13. Ces exemples montrent comment le contrôle du cycle cellulaire peut être mesurée en réponse à une variété de stimuli ou de manipulations cellulaires. Cette approche peut donc être adapté à de nombreuses applications qui nécessitent la mesure de la position du cycle cellulaire dans des expériences de type de culture. Figure 1. Quantittion des phases du cycle cellulaire par l'iodure de propidium combinés et coloration BrdU (PI-BrdU). (A) Ce panneau affiche trois dimensions de la cytométrie de flux et de l'iodure de propidium cellules colorées BrdU. Notez que les cellules avec du contenu en ADN 2N et 4N sont centrées sur les 200 et 400 marques sur l'échelle de l'axe X pour l'intensité de coloration de propidium iodure. Intensité de coloration BrdU est mesurée sur une échelle logarithmique sur l'axe Y. Notez la position des portes utilisées pour quantifier les cellules dans les phases G1, S et G2 / M du cycle cellulaire. (B) la proportion relative de cellules dans chacune des portes G1, S et G2 / M de A sont représentées sur ce graphique. Figure 2. Quantification des phases du cycle cellulaire dans les cellules sélectionnées en utilisant l'iodure de propidium et le marqueur CD20 à la surface cellulaire. (A) Ce panneau indique l'iodure de propidium et CD20 coloration pour un mélange de cellules, dont certaines expriment le CD20 ectopique et pRB. Notez que les cellules avec2N et de l'ADN 4N (les populations les plus abondantes) sont centrées sur les 200 et 400 marques sur l'axe X. La position de la porte de CD20 + sélectionne les cellules qui sont colorées d'au moins 10X plus brillamment que de fond. (B) Un graphique de la numération cellulaire par rapport coloration iodure de propidium est indiqué pour le CD20 des cellules négatives dans le panneau A qui sont en mode asynchrone prolifèrent. (C) Un graphique similaire est indiqué pour le CD20 des cellules positives à partir du panneau A qui ont été induits à l'arrestation à l'expression de pRB et contiennent des cellules avec du contenu en ADN principalement 2N. Cela démontre que l'arrêté sous-population peuvent être distinguées des autres cellules de cette culture en utilisant cette technique de coloration. Figure 3. Inhibition de la prolifération cellulaire par p27KIP1. (A) PI-BrdU analyse est utilisée pour mesurer les phases du cycle cellulaire dans une population asynchrone prolifération de cellules qui ont été transduites avec une vecto vides rétroviraux pBABER. (B) Une analyse similaire des cellules transduites avec pBABE-p27. Notez l'absence de cellules dans la phase S et une plus grande intensité des événements dans G1 et G2 / M portes. (C) La quantification des cellules dans les phases respectives du cycle cellulaire en mode asynchrone prolifèrent de contrôle et des cellules exprimant p27. Figure 4. Inhibition de la prolifération cellulaire par le TGF-β1 (A) PI-BrdU analyse de manière asynchrone cellules proliférantes MCF10A. (B) Analyse des cellules traitées avec 100 pM de TGF-β1 pendant 24 heures. Notez l'accumulation de cellules principalement dans la phase G1 du cycle cellulaire. (C) Validation de la coloration BrdU en remplaçant l'anticorps anti-BrdU primaire avec un contrôle non-IgG spécifiques dans les cellules prolifèrent de manière asynchrone. (D) quantification graphique des phases respectives du cycle cellulaire de A et B. <br/> Figure 5. Inhibition de la prolifération cellulaire par pRB. (A) par rapport comptages cellulaires coloration iodure de propidium de CD20 et de ß-gal cellules transfectées est montré. Ceci est un contrôle important que la transfection peut partiellement synchroniser les cellules, ce qui rend la population non transfectées (CD20 – cellules) comme un contrôle inapproprié pour le transfectées sous-population. Les cellules transfectées ont besoin d'être comparé à d'autres cellules transfectées de façon analogue. (B) comptages cellulaires par rapport graphe d'iodure de propidium CD20 et pRB cellules transfectées. A noter la présence quasi exclusive d'un pic de 2N. (C) Représentation graphique des proportions du cycle cellulaire de phase déterminée à partir de A et B en utilisant des méthodes d'ajustement des courbes dans le logiciel cycle pluriannuel.