Analyse van celcyclus Positie in zoogdiercellen

1. Etikettering en de bevestiging van de cellen Voeg 1 ul van celproliferatie Labeling Reagent (BrdU) per ml celkweekmedium (1 tot 1000 verdunning) 1 uur voor de oogst. De etikettering periode moet mogelijk worden verlengd voor de langzamer groeiende cellen. Om de oogst cellen, aspireren kweekmedium en grondig wassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Herhaal dit om grondig te verwijderen sporen van medium. Snel wassen culturen een derde keer met PBS dat 3mm EDTA en zuig grondig. Voeg een klein volume PBS, met 3 mm EDTA bij elk gerecht, 0,5 ml voor een 6 cm schotel is ideaal. Incubeer bij 22 ° C gedurende ongeveer 5 minuten aan cellen los te maken. Transfer naar een 15 ml conische buis. Centrifugeer cellen op 500 xg gedurende 5 minuten om pellet, verwijder supernatant, en resuspendeer grondig in 100 pi PBS. Fix-cellen door toevoeging van 5 ml 95% EtOH, druppelsgewijs, terwijl de vortexen. In deze stap kunnen cellen worden bewaard bij 4 ° C gedurende ten minste eenmaanden. 2. Denaturering en kleuring van BrdU en DNA Centrifugeer cellen op 500 xg gedurende 5 minuten te pellet cellen en verwijder 95% EtOH. Resuspendeer in 1 ml 2N HCl en 0,5% Tx-100 door het toevoegen van in een druppelsgewijs fashion tijdens het vortexen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Centrifuge zoals eerder in paragraaf 2.1 en zorgvuldig aspireren supernatans, omdat de cellen vormen een zeer losse pellet bij deze stap. Voorzichtig hersuspenderen in 1 ml 0,1 M NaB 4 O 7 (pH 8,5) en gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur. Pellet cellen zoals hierboven in paragraaf 2.1 en resuspendeer in 0,5 ml van de antilichaam-oplossing (PBS dat 1% BSA en 0,2% Tween-20) met muis anti-BrdU-antilichamen verdund 1 tot 50. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Pellet-cellen opnieuw en opnieuw in suspensie in 50 ml van het antilichaam oplossing met konijn anti-muis secundaire antilichamen geconjugeerd met FITC verdund 1 tot 25. Incubeer gedurende 30 minuten opwerkblad en beschermen tegen licht. Centrifuge cellen een laatste keer en resuspendeer in 0,5 ml propidiumjodide en RNase oplossing (PI-RNAse-oplossing, PBS met 1% BSA, 10 mg / ml propidiumjodide, 0,25 mg / ml RNase A) en incubeer in het donker bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Als alternatief RNA kan 's nachts worden verteerd bij 4 ° C in het donker. Passeren oplossing door een cel zeef om aggregaten te verwijderen en enkele cellen te verzamelen in een geschikt voor monster-opname op uw flowcytometer. Nogmaals, moeten monsters worden beschermd tegen directe blootstelling aan licht. 3. Analyse door flowcytometrie De cellen dienen te worden geanalyseerd door een standaard flowcytometer die in staat is te discrimineren doubletten (twee cellen die passeren de stroom cel als een) met de juiste detectie mogelijkheid voor propidiumjodide en FITC. Enkele cellen kunnen worden gedetecteerd in dit flowcytometrie aanvraag van gating voor evenementen op basis van forward scatter en zijwaartse verstrooiing popvraagd, en door gebruik te maken van de eigenschappen van DNA kleuring door propidiumjodide. Het uiterlijk van een doublet discriminerende puntenplot varieert tussen flowcytometers en vertrouwt op propidiumjodide kleuring eigenschappen, zie uw lokale flowcytometrie faciliteit voor advies over het opzetten van een doublet discriminator in uw analyse. In het algemeen, een asynchroon prolifererende populatie van cellen, enkele cellen zijn meestal de twee meest voorkomende pieken (2N en 4N DNA) in het doublet discriminerende plot en een hek moeten worden getrokken om hen heen. Hiermee selecteert u cel gebeurtenissen die worden gebruikt hieronder voor alle volgende analyse. Het eerste monster te analyseren moet een asynchroon prolifererende cultuur die fungeert als een positieve controle voor kleuring en flowcytometer set-up te zijn. Pas de gevoeligheid van de fotomultiplicatorbuizen voor propidiumjodide kleuring zodanig dat de 2N en 4N pieken van singlet cellen zijn gecentreerd op 200 en 400 (willekeurige eenheden) op de X-as. We vaak een vlek overvloedige sals levering van deze cellen om ervoor te zorgen dat alle parameters van de flowcytometer naar behoren zijn aangepast zonder gebruik te maken van dit monster. Deze positieve controle is ook nuttig voor nieuwe gebruikers om meer vertrouwd te raken met de werking van de flowcytometer. Pas de gevoeligheid van de fotomultiplicator buis voor FITC detectie zodanig dat G1 en G2 / M bevolking boven de achtergrond. BrdU-positieve cellen, moet ongeveer 10 keer helderder en de Y-as moet worden weergegeven als een logaritmische schaal. Het is soms handig om ook een negatieve controle voor BrdU kleuring (door vervanging van de anti-BrdU-antilichamen met niet-specifieke IgG in stap 2.3 hierboven) om een ​​duidelijk onderscheid positief gekleurde cellen. Pas compensatie tussen propidiumjodide en FITC zodanig dat enkele gebeurtenissen gevangen genomen door de flowcytometer vormen een hoefijzervormige boog van G1 in de linker tot aan de S-fase en naar beneden in de rechter benedenhoek voor de G2 / M. Raadpleegt u het volgende verzoek om een ​​meer diepgaande discussie van de principes en het gebruik van flowcytometrie en verwijzingen daar in voor specifieke toepassingen 2. 4. Data-analyse 5 000 tot 10 000 cel evenementen met de gewenste reikwijdte van DNA-inhoud moet worden verzameld voor elk monster teneinde het vertrouwen dat de bevolking van cellen in de cultuur grondig bemonsterd zijn. Zodra cellen zijn gemeten voor propidiumjodide en BrdU content die ze nodig hebben om te worden toegewezen aan de G1, S of G2 / M fasen. Doe dit door het opstellen hekken rond de twee BrdU negatieve populaties gecentreerd op 200 en 400 (G1 en G2 / M respectievelijk). Alles wat boven deze dozen moeten worden opgenomen in een enkele poort die de S-fase (fig. 1A) maatregelen. Het percentage van de cellen in elke poort staat voor het relatieve aantal cellen in de G1, S en G2 / M (Fig. 1B). 5. Alternatief protocol voor de analyse van celcyclus in een gemengde populatie van cellen Deze alternatieve protocol ishet meest nuttig wanneer transfectie van expressievectoren routinematig resulteert in een laag percentage van cellen die het gen product van belang, of wanneer de behandeling met geneesmiddelen om een ​​zuivere populatie van cellen te selecteren onpraktisch is. Dit resulteert in een relatief klein deel van de cellen van belang zijn besmet met een grote populatie van untransduced cellen. In dit geval, co-transfecteren plasmiden het uiten van je gen of shRNA van belang, samen met een plasmide dat een marker uitdrukt voor het detecteren van getransfecteerde cellen door flowcytometrie, zoals een membraan verankerd GFP 3, of een vreemde celoppervlak marker, zoals CD 19 4 of CD20 5. Voor de toepassing van dit protocol zullen we CD20 vlekken te gebruiken als een voorbeeld, maar kleuring voor CD19 is in wezen identiek. In het geval van transfectie met CD20, is er geen noodzaak om BrdU label, eenvoudigweg oogst cellen zoals beschreven in de stappen 1,2 tot 1,5 hoger en vlekken door het toevoegen van 20 pi FITC-geconjugeerd anti-CD20 antilichamen tegen de cellen op ice gedurende 20 minuten in het donker. Fix-cellen zoals beschreven in stap 1.6. Cellen kunnen weer worden opgeslagen voor minstens een maand bij 4 ° C in het donker. Voor de detectie van GFP, laat het antilichaam vlekken van deze stap en vast te stellen en op te slaan cellen zoals beschreven. Re-hydraat de cellen door pelleteren in de centrifuge op 500 xg gedurende 5 minuten en resuspenderen in 5 ml PBS dat 1% BSA. Re-pellet de cellen op 500 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer cellen in 0,5 ml propidiumjodide en RNase oplossing zoals hierboven beschreven in paragraaf 2.5. Blijf celpreparaat instructies op te volgen in 2.6 en analyse van de instructies in de punten 3.1 en 3.2. Pas de gevoeligheid van de fotomultiplicator buis voor FITC detectie zodanig dat ongekleurde cellen boven de achtergrond. Idealiter zal CD20-positieve cellen worden FITC 10x tot 100x intenser gekleurd dan de achtergrond en de Y-as van deze grafiek moet worden weergegeven als een logaritmische schaal (Fig. 2A). CD20 positieve cellen die 10x helderder dan backgronde (en met propidiumjodide kleuring tussen de 200 en 400) moet worden geselecteerd voor weergave in een propidiumjodide versus-cel-tellingen histogram zoals getoond in Fig. 2C. Voor cellijnen die markers die gemakkelijk zijn helder gekleurd (dwz 10X tot 100X boven achtergrond) de CD20 positieve cut-off moet worden vastgesteld op 10X achtergrond te drukken. Opname van zwakkere kleuren van cellen verhoogt variabiliteit in deze experimenten, waarschijnlijk omdat het gen van belang is ook zwak uitgedrukt in deze cellen. Voor cellijnen die alleen rendement zwak gekleurd CD20-positieve (dwz minder dan 10x achtergrond), vaststelling van een afgesneden moet worden gemaakt met behulp van een negatieve controle bestaat uit CD20 gekleurde, ongetransfecteerde cellen. Tenminste 1000 CD20 positieve gebeurtenissen moeten worden verzameld voor elk monster. Experimenten met minder dat 1000 evenementen van hoge variabiliteit. Softwarepakketten zoals ModFit LT (Verity Software), Multi Cycle AV (Phoenix Flow Systems), en Flow Jo (Tree Star) te gebruiken wiskundige schattingen vande G1, S en G2 / M populaties die bijdragen aan de vorm van de curve in de histogrammen, zoals die getoond in Fig. 2B en C. 6. Representatieve resultaten: Wij bieden drie voorbeelden van experimentele celcyclus analyses met behulp van onze aanpak. De eerste maakt gebruik van retrovirale expressie van cycline afhankelijke kinase remmer p27KIP1 in muis embryonale fibroblasten. Vierentwintig uur na de drug selectie voor virale infectie was voltooid, werden de cellen puls gemerkt met BrdU gedurende een uur. In dit experiment ectopische expressie van de remmer wordt gebruikt om de proliferatie van de cellen (Fig. 3A en B) te arresteren. Zoals getoond in Fig. 3B weinig BrdU positieve gebeurtenissen zijn duidelijk in de S-fase gate in reactie op p27. Ook het percentage cellen in de S-fase voor p27 tot expressie brengen is vrij laag als diagramed in Fig. 3C. Dit soort analyse is zeer effectief in het karakteriseren van de controle van de celcyclus defecten in cellen afkomstig zijn van verschillende stammen van geen-gerichte muizen 6, 7, 8. In het tweede experiment werden ongetransformeerde mamma-epitheel cellen (MCF10A) behandeld met de groei-remmende cytokine, transforming growth factor beta een (TGF-β1) voor 24 uur. Cellen werden gemerkt met BrdU gedurende vier uur onmiddellijk voorafgaand aan de oogst. Zoals getoond in Fig. 4 BrdU etikettering in de S-fase cellen is sterk verminderd door TGF-β1 signalering, is de specificiteit van onze kleuren ook gevalideerd met een IgG negatieve controle (fig. 4C). Kwantificering van de verschillende fasen van de celcyclus bevestigt dat TGF-β1 voornamelijk proliferatie remt in de G1 fase van de celcyclus, wat leidt tot een accumulatie in deze fase. In ons laatste voorbeeld, zijn PRB tekort Saos-2 cellen getransfecteerd met een CMV-CD20 expressievector en een CMV-RB of CMV-β-Gal als een controle. Drie dagen na transfectie werden de cellen geoogst, gekleurd, en vaste. Flowcytometrie analyse van deze cels is te zien in Fig. 5. Dit toont de celcyclus verdeling van de negatieve controle getransfecteerde cellen (Fig. 5A) in vergelijking met de distributie volgende 72 uur van PRB expressie (Fig. 5B). Volgende curve fitting door Multi Cycle-software, is een directe vergelijking van het aandeel van de fasen van de celcyclus getoond in Fig. 5C. Dit onthult de ophoping van cellen in de G1 na PRB expressie en de relatieve afname van cellen uit de S-en G2 / M fasen. We hebben gebruik gemaakt variaties op deze test aan G1 arrestatie mechanismen uitgebreid 9, 10, 11, 12, 13 probe. Deze voorbeelden laten zien hoe controle van de celcyclus kan worden gemeten in reactie op een verscheidenheid van stimuli of cel manipulaties. Deze aanpak kan dus aangepast worden aan vele toepassingen die het meten van de celcyclus positie in de cultuur van het type experimenten vereisen. Figuur 1. Quantitatie van de fasen van de celcyclus door gecombineerde propidiumjodide en BrdU kleuring (PI-BrdU). (A) Dit paneel geeft drie dimensionale flow cytometrie van propidiumjodide en BrdU gekleurde cellen. Merk op dat cellen met 2N en 4N DNA-inhoud worden gecentreerd over de 200 en 400 tekens op de X-as schaal voor propidiumjodide kleuringsintensiteit. BrdU kleuring intensiteit wordt gemeten op een logaritmische schaal op de Y-as. Let op de positie van de poorten gebruikt om cellen te kwantificeren in de G1, S en G2 / M fasen van de celcyclus. (B) Het relatieve aandeel van de cellen in elk van de G1, S en G2 / M gates van A worden getoond op deze grafiek. Figuur 2. Kwantificering van fasen van de celcyclus in de geselecteerde cellen met behulp van propidiumjodide en het celoppervlak marker CD20. (A) Dit paneel propidiumjodide en CD20 aankleuring voor een mengsel van cellen laat zien, waarvan sommige ectopisch uitdrukken CD20 en PRB. Merk op dat de cellen met2N en 4N DNA (het meest voorkomende populaties) zijn gecentreerd boven de 200 en 400 punten op de X-as. De positie van de CD20 + poort selecteert cellen die zijn gekleurd minstens 10x feller dan de achtergrond. (B) Een grafiek van het bloedbeeld versus propidiumjodide kleuring is getoond voor CD20 negatieve cellen in panel A, die asynchroon vermenigvuldigen. (C) Een soortgelijke grafiek wordt weergegeven voor CD20 positieve cellen van panel A die zijn geïnduceerd te arresteren met PRB expressie en cellen met in de eerste plaats 2N DNA inhoud bevatten. Dit toont aan dat een aangehouden sub-populatie kan worden onderscheiden van andere cellen in deze cultuur het gebruik van deze vlekken techniek. Figuur 3. Remming van de celproliferatie door p27KIP1. (A) PI-BrdU-analyse wordt gebruikt om de fasen van de celcyclus te meten in een asynchroon prolifererende populatie van cellen die werden getransduceerd met een lege pBabe retroviraal vector. (B) Een soortgelijke analyse van cellen getransduceerd met pBabe-p27. Let op de afwezigheid van cellen in de S-fase en een grotere intensiteit van de gebeurtenissen in de G1 en G2 / M poorten. (C) Kwantificering van cellen in de respectievelijke fasen van de celcyclus in asynchroon prolifererende controle en p27 tot expressie brengen. Figuur 4. Remming van celproliferatie door TGF-β1 (A) PI-BrdU analyse van asynchroon prolifererende MCF10A cellen. (B) analyse van cellen behandeld met 100 pM van TGF-β1 voor 24 uur. Let op de accumulatie van cellen in de eerste plaats in de G1 fase van de celcyclus. (C) Validatie van BrdU kleuring door het vervangen van de anti-BrdU primaire antilichaam met een niet-specifieke IgG controle in asynchroon prolifererende cellen. (D) Grafische kwantificering van de respectievelijke fasen van de celcyclus van A en B. <br/> Figuur 5. Remming van de celproliferatie door PRB. (A) Cell telt versus propidiumjodide kleuring van CD20 en ß-gal getransfecteerde cellen wordt getoond. Dit is een belangrijk controle transfectie kan deels synchroniseren cellen, waardoor de ongetransfecteerde bevolking (CD20 – cellen) als een ongepaste controle voor de getransfecteerde sub-populatie. Getransfecteerde cellen moeten worden vergeleken met andere analoge getransfecteerde cellen. (B) Cell telt versus propidiumjodide grafiek van CD20 en PRB getransfecteerde cellen. Let op de bijna exclusieve aanwezigheid van een 2N piek. (C) Grafische weergave van de fase van de celcyclus proporties bepaald op basis van A en B met behulp van curve fitting methoden in Multi Cycle software.