تحليل المركز دورة الخلية في خلايا الثدييات
Summary
تحديد موقف دورة الخلية من مجموعة من الخلايا ، أو فهم الكيفية التي تؤثر على انتشار الاشارات ، يمكن قياس التدفق الخلوي بسهولة باستخدام هذا البروتوكول. نحن التقرير مقاربة بسيطة التجريبية لخلايا التلوين وقياس موقفهم في دورة الخلية.
Abstract
تنظيم تكاثر الخلايا والأنسجة المركزية إلى التشكل خلال تطوير الكائنات المتعددة الخلايا. وعلاوة على ذلك ، وفقدان السيطرة على انتشار الخلايا تكمن وراء أمراض من أمراض مثل السرطان. على هذا النحو هناك حاجة كبيرة لتكون قادرة على التحقيق في تكاثر الخلايا وquantitate نسبة الخلايا في كل مرحلة من مراحل دورة الخلية. كما أنها ذات أهمية حيوية لتحديد الخلايا التي يتم indistinguishably تكرار الحمض النووي في غضون عدد أكبر من السكان. منذ قرار يرصد خلية لتتكاثر في المرحلة G1 مباشرة قبل الشروع في تركيب الحمض النووي والتقدم خلال الفترة المتبقية من دورة الخلية ، واكتشاف تركيب الدنا في هذه المرحلة يسمح لعزم لا لبس فيه للوضع القائم للتنظيم نمو الخلايا في الثقافة التجارب.
يمكن أن يكون محتوى الحمض النووي في الخلايا quantitated بسهولة التدفق الخلوي للخلايا ملطخة يوديد propidium ، صبغة الفلورسنت الإقحام الحمض النووي.وبالمثل ، يمكن quantitated نشطة من قبل خلايا الحمض النووي التوليف زراعة في حضور ثيميدين المشعة ، حصاد الخلايا ، وقياس النشاط الاشعاعي في إدراج جزء غير قابل للذوبان حمض an. لدينا خبرة كبيرة مع تحليل دورة الخلية وتوصي باتباع نهج مختلف. نحن بالتحقيق في انتشار الخلايا باستخدام bromodeoxyuridine / fluorodeoxyuridine (مختصر كمجرد BrdU) تلطيخ يكشف عن إدراج هذه النظير الثايمين في الحمض النووي توليفها في الآونة الأخيرة. التوسيم وتلطيخ الخلايا مع BrdU ، جنبا إلى جنب مع تلطيخ DNA مجموع يوديد propidium وتحليلها من جانب التدفق الخلوي 1 يوفر المقياس الأكثر دقة من الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية. هو الأسلوب المفضل لدينا لأنه يجمع بين اكتشاف تركيب الدنا نشطة ، من خلال تلطيخ القائمة على الضد BrdU ، مع محتوى الحمض النووي من مجموع يوديد propidium. وهذا يسمح لفصل واضح للخلايا في مرحلة مبكرة من G1 S ، أو S في وقت متأخر من مرحلة G2 / م.وعلاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذا النهج لتحقيق العديد من الآثار منبهات مختلفة من الخلايا وكلاء الصيدلانية على التقدم من خلال تنظيم هذه المراحل دورة الخلية المختلفة.
في هذا التقرير وصفنا طرق لوضع العلامات وتلطيخ الخلايا المستزرعة ، وكذلك من خلال تحليل التدفق الخلوي. نحن تشمل أيضا أمثلة تجريبية لكيف يمكن استخدام هذه الطريقة لقياس الآثار المترتبة على تثبيط نمو إشارات من السيتوكينات مثل TGF – β1 ، ومثبطات التكاثري مثل مثبط كيناز cyclin التابعة ، p27KIP1. علينا أيضا أن تشمل بروتوكول بديل يسمح لتحليل الموقف في دورة الخلية من الفئات السكانية الفرعية داخل الخلايا أكبر ثقافة 5. في هذه الحالة ، ونحن لشرح كيفية الكشف عن اعتقال خلية في دورة transfected خلايا الشبكية مع الجينات حتى عندما فاق عدد كبير من الخلايا untransfected في الثقافة نفسها. هذه الأمثلة توضح العديد من الطرق التي الحمض النووي وتلطيخويمكن استخدام التدفق الخلوي وتكييفها للتحقيق في المسائل الأساسية للسيطرة دورة الخلية الثديية.
Protocol
Discussion
في تجربتنا ، والنجاح مع هذه التقنيات تعتمد على مفتاح التحكم قليلة والظروف التجريبية. واحد هو إقامة سيطرة المتكاثرة بشكل غير متزامن لاستخدامها في هذه التجارب. هذه السيطرة يخدم ثلاثة أغراض هامة. الأولى ، فإنه يضمن ظروف ثقافة المستخدمة لجميع العينات التجريبية هي كافية لدعم الانتشار المتواصل في غياب العلاج. هذه العينة أيضا يخدم الغرض من مراقبة إيجابية لتلطيخ منهجية لضمان أن يتم الكشف عن خلايا CD20 BrdU أو إيجابية عندما كانت موجودة. أخيرا ، يتم استخدام هذه العينة لمعايرة عداد الكريات التدفق. ويمكن استخدام هذا النموذج التحكم لضبط شدة propidium تلطيخ يوديد للكشف عن خلايا 2N و4N في 200 و 400 على التوالي. وعلاوة على ذلك ، يمكن ضبط حساسية الكشف عن BrdU أو CD20 بحيث تتركز إشارات سلبية وإيجابية كما هو مبين في الأرقام و1A 2A. عندما يكون جميع العينات تركزا مماثلا من الخلايا في PI – RNase الحل ، ثم هناك حاجة إلى بعض التعديلات في عداد الكريات كما يتم تشغيل عينات لاحقة. هذا مهم لأسباب المبينة في الشكل. 4B 5B وقوية حيث تراكم يخلق أساسا G1 G1 ذروة واحدة يمكن ان يساء تفسيرها على أنها G2 / م.
التجارب أيضا جعل ممثل نقطة هامة أخرى. بادئ ذي بدء ، فإنها تثبت أن BrdU امتصاص ووضع العلامات يمكن أن تتفاوت بين أنواع الخلايا. لهذا السبب من المهم تجريبيا لتحديد طول النبض والشروط اللازمة للكشف عن تلطيخ الخلايا على نحو كاف في S – المرحلة. عموما ، يمكن أن توصف أنواع الخلايا التي مزدوجة في الثقافة في 24 ساعة أو أقل مع BrdU في ساعة واحدة. قد أبطأ أنواع الخلايا المتزايدة تتطلب تعد البقول وتعديلات على الشروط تلوين الأجسام المضادة ومدتها. خلايا MCF10A هي مثال ممتاز في هذا الصدد كما وصفت لهم BrdU لمدة أربع ساعات والملون مع التركيز على ضعف مستوى الأجسام المضادة لمدة أربعة أضعاف طويلة. محققونيجب أن نكون حذرين بحيث لا يتجاوز 6 ساعات من وضع العلامات BrdU حتى مع تزايد الخلايا ببطء شديد لأن ذلك يمكن أن يؤدي خطأ إلى إدراج G2 / M الخلايا في السكان S – المرحلة. ثانيا ، في المقارنة بين آثار p27KIP1 التعبير مع تلك TGF – β1 ، فمن الواضح أن P27 يمكن أن تحدث في أي تراكم أو المراحل G1 G2 / M – β1 TGF بينما يشير يؤدي الى اعتقال G1. الوسائل التقليدية للكشف عن انتشار مثل إدماج H – 3 ثيميدين والتلألؤ عد غير قادر على التمييز بين هذه الاحتمالات.
في بروتوكول لدينا بديل نظهر للكشف عن مجموعة من السكان فرعية من الخلايا في عدد السكان أكبر untransfected. من المهم تحديد تجريبيا الصحفي الأكثر ملاءمة للكشف عن خلايا transfected. تجربتنا في بعض أنواع الخلايا إما عن سطح الخلية علامات سيئة ، أو لا يمكن المرور عليها بشكل صحيح إلى غشاء البلازما ، مما أدى إلى عدم القدرة على الكشف عن خلايا transfected. Likewise ، وليس كل الخلايا تحمل شكل غشاء ملزمة للGFP. وينبغي أن يتم الاختيار لمراسل أنسب من خلال تقييم كفاءة ترنسفكأيشن لمراسل وكذلك الكثافة النسبية للتعبير مقارنة مع الضوابط untransfected. من الناحية المثالية ، سيتم تعبير مغايرة لهذه الجزيئات جيد التحمل ، وهذا يوحي بأن ليس لديهم علامات على أي تأثير على توزيع دورة الخلية.
القيد واحد من هذه الأنواع من نهج التدفق الخلوي هو أنها الوحيدة القادرة على وضع فرة نسبية من مراحل دورة الخلية مقارنة مع بعضها البعض. لهذا السبب فهو تعبير عن حالة غامضة P27 في الشكل 3 يدفع حقا الاعتقال في G1 و G2 / M ، أو إذا كان مجرد يبطئ تقدم من خلال هذه المراحل بالنسبة إلى S – المرحلة. ويمكن تحقيق المزيد من هذه الاحتمالات من خلال معالجة عينة من الخلايا المتوازية مع مثبط الإنقسامية مثل nocodazole ، أو G1 / S مثبط مثل aphidicolin. منذ إنشاء هذه الأدوية دوميناNT الاعتقال في المرحلة M – S – أو أوائل مرحلة على التوالي ، وسوف تتراكم ببطء الخلايا المتكاثرة في اعتقال نقطة المخدرات التي يسببها. لسوف الخلايا سبيل المثال ألقي القبض عليه في G1 بسبب التعبير PRB البقاء في G1 على الرغم من العلاج في حين أن الخلايا nocodazole السيطرة سوف تتراكم في المرحلة M – 13.
أخذت معا ، وهذه المناهج التجريبية تقترح منهجية مرنة يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من الأسئلة أبحاث الخلايا الثديية دورة. فإنها يمكن بسهولة اكتشاف تغيرات في تطور دورة الخلية وتحديد الاختلافات عند مقارنة مع الضوابط.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب نود أن نشكر المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) وجمعية السرطان الكندية للحصول على تمويل أبحاث الخلايا دورة في المختبرات الخاصة بهم. MJC هي المستفيدة من منحة MD / دكتوراه من CIHR. MJC والماجستير هي أعضاء في برنامج التدريب CaRTT.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Cell Proliferation Labeling reagent | GE Amersham | RPN201 | |
| Anti-BrdU Antibodies | BD Biosciences | 347580 | |
| Anti-Mouse FITC conjugated Antibodies | Vector Labs | FI-2000 | |
| Cell Strain Filters | BD Falcon | 352235 | |
| Anti-CD20 Antibodies | BD Biosciences | 347673 | |
| Multi Cycle Software | Phoenix Flow Systems | N/A |
References
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80, 5573-5573 (1983).
- Givan, A. L. Flow cytometry: an introduction. Methods. Mol. Biol. 699, 1-1 (2011).
- Kalejta, R. F., Brideau, A. D., Banfield, B. W., Beavis, A. J. An integral membrane green fluorescent protein marker, Us9-GFP, is quantitatively retained in cells during propidium iodide-based cell cycle analysis by flow cytometry. J. Exp. Cell. Res. 248, 322-322 (1999).
- Qin, X. -. Q. The transcription factor E2F-1 is a downstream target of RB action. Molecular and Cellular Biology. 15, 742-742 (1995).
- van den Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262, 2050-2050 ( ).
- Henley, S. A. A cancer derived mutation in the retinoblastoma gene with a distinct defect for LXCXE dependent interactions. Cancer Cell. Int. 10, 8-8 (2010).
- Francis, S. M. A functional connection between pRB and transforming growth factor beta in growth inhibition and mammary gland development. Mol. Cell. Biol. 29, 4455-4455 (2009).
- Isaac, C. E. The retinoblastoma protein regulates pericentric heterochromatin. Mol. Cell. Biol. 26, 3659-3659 (2006).
- Julian, L. M. Characterization of an E2F1-specific binding domain in pRB and its implications for apoptotic regulation. Oncogene. 27, 1572-1572 (2008).
- Hirschi, A. An overlapping kinase and phosphatase docking site regulates activity of the retinoblastoma protein. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 1051-1051 (2010).
- Dick, F. A., Dyson, N. pRB contains an E2F1-specific binding domain that allows E2F1-induced apoptosis to be regulated separately from other E2F activities. Mol. Cell. 12, 639-639 (2003).
- Dick, F. A., Sailhamer, E., Dyson, N. J. Mutagenesis of the pRB pocket reveals that cell cycle arrest functions are separable from binding to viral oncoproteins. Mol. Cell. Biol. 20, 3715-3715 (2000).
- Dick, F. A., Dyson, N. J. Three regions of the pRB pocket domain affect its inactivation by human papillomavirus E7 proteins. J. Virol. 76, 6224-6224 (2002).
