Vi beskriver en metode som kombinerer automatisert celledyrking med høyt innhold bildebehandling for å visualisere og kvantifisere multiple cellulære prosesser og strukturer i en high-throughput måte. Slike metoder kan hjelpe i den videre funksjonell annotering av genomer samt identifisere sykdom genet nettverk og potensielle narkotika mål.
Den funksjonelle annotering av genomer, bygging av molekylære nettverk og romanen narkotika mål identifikasjon, er viktige utfordringer som må tas opp som en sak av stor haster 1-4. Flere komplementære 'omics' tilnærminger har gitt ledetråder til den genetiske risikofaktorer og sykdomsfremkallende mekanismer underliggende mange nevrodegenerative sykdommer, men de fleste funn fortsatt krever funksjonelle validering 5. For eksempel er en nylig genom bredt forening studie for Parkinsons sykdom (PD), identifisert mange nye loci som risikofaktorer for sykdommen, men den underliggende utløsende variant (s) eller sykdomsfremkallende mekanisme ikke kjent 6, 7. Som hvert tilhørende område kan inneholde flere gener, ville funksjonell evaluering av hver av gener på fenotyper assosiert med sykdommen, ved hjelp av tradisjonelle cellebiologi teknikker tar for lang tid.
Det er også behov for å forstå de molekylære nettverk som lenkergenetiske mutasjoner til fenotyper de forårsaker. Det forventes at sykdommen fenotyper er resultatet av flere interaksjoner som har blitt forstyrret. Rekonstruksjon av disse nettverkene bruker tradisjonelle molekylære metoder vil være tidkrevende. Videre vil nettverket spådommer fra uavhengige studier av individuelle komponenter, reduksjonisme tilnærming, sannsynligvis undervurdere nettverket kompleksitet 8. Dette undervurdering kan, delvis forklare den lave suksessrate på narkotika godkjennelse på grunn av uønsket eller giftige bivirkninger. Å få et nettverk perspektiv av sykdomsrelaterte pathways bruker HT / HC cellular screening tilnærminger, og identifisere viktige noder i disse banene, kan føre til identifisering av mål som er mer egnet for terapeutisk intervensjon.
High-throughput screening (HTS) er en ideell metode for å løse disse problemene 9-12. men tradisjonelle metoder ble endimensjonalt hel-brønn celle-analyser, som pleide å forenklestic avlesninger for komplekse biologiske prosesser. De var ikke i stand til samtidig kvantifisere mange fenotyper observert i nevrodegenerative sykdommer som aksonal transport underskudd eller endringer i morfologi egenskaper 13, 14. Denne tilnærmingen kunne ikke brukes til å undersøke dynamiske natur cellulære prosesser eller sykdomsfremkallende hendelser som oppstår i en undergruppe av celler. Å kvantifisere slike funksjoner man har å flytte til multi-dimensjonale fenotyper kalt high-innhold screening (HCS) 4, 15-17. HCS er cellen-basert kvantifisering av flere prosesser samtidig, noe som gir en mer detaljert fremstilling av cellulær respons til ulike forstyrrelser i forhold til HTS.
HCS har mange fordeler over 18 HTS, 19, men gjennomfører en high-throughput (HT)-high-innhold (HC)-skjermen i neuronal modeller er problematisk på grunn av høye kostnader, miljø variasjon og menneskelige feil. For å påvise cellulære responser på en 'phenomics' skalahjelp av HC bildebehandling man har til å redusere variasjon og feiling, mens økende følsomhet og reproduserbarhet.
Heri vi beskriver en metode for nøyaktig og pålitelig oppførsel shRNA skjermer bruker automatiserte celledyrking 20 og HC bildebehandling i neuronal cellulære modeller. Vi beskriver hvordan vi har brukt denne metoden for å identifisere modulatorer for ett bestemt protein, DJ1, som når mutert forårsaker autosomal recessiv parkinsonisme 21.
Kombinere allsidig HC bildebehandling med HT metoder, er det mulig å nøyaktig kvantifisere en mengde fenotyper. Dette kan senere benyttes til å fremme vår forståelse av genomet, den veier involvert i sykdom patogenesen samt identifisere potensielle terapeutiske mål.
Med den synkende kostnadene for HT / HC cellulære screening systemer, kombinert med tilgjengeligheten av kraftige genome-wide verktøy for å endre gen-funksjon, er HT / HC-skjermer blir vanlig i akademia. Tilnærmingen har allerede blitt brukt til ulike forskningsområder som identifisering av narkotika mål i 9 kreft, 31-33 og embryoutvikling 34-36 og selv har potensial for anvendelse i tyde på stier involvert i nevropsykiatriske lidelser 37,38. Men gjennomføring av et slikt system krever en betydelig investering av tid og krefter med prosessoptimalisering ofte ta minimum 6 måneder. Alle trinn, slik som trypsinization tider, pipettering hastigheter og seeding tettheter må justeres, for å sikre at cellene er friske og vokser stadig. Forebygging av bakteriell forurensning er en av de vanskeligste utfordringene automatisert cellekultur med ukentlig rengjøring protokoller i combination med konstant skylling av alle flytende peilelinjaler med 70% etanol er nødvendig for forurensning gratis kulturer. Det vil også være nødvendig å forbedre robotikk, slik at flere instrumenter, slik som confocal mikroskoper for høyere oppløsning og -80 ° C frysere for sammensatte lagring kan bli integrert.
Det er også begrensninger som må tas opp for å forbedre den følsomme, hastighet og nytten av denne metoden for å studere gen nettverk og identifisere gener involvert i patogene molekylære stier.
Å gjennomføre en HT / HC-skjermen og sørge for at pålitelige data samles inn, flere aspekter må optimaliseres. Først er påliteligheten av målingen Paramount og er avhengig av robusthet og følsomhet analysen. For eksempel analysene beskrevet ovenfor er egnet for mindre skjermer, men er vanskelig å gjennomføre på et genom bred skala, på grunn av antall prosesstrinn kreves før image oppkjøpet.Dermed ville man nødt til å konstruere stabile cellelinjer som uttrykker reporter genet, som ville tillate for direkte avbildning og føre til redusert variasjon på grunn av redusert antall prosessering trinn. I dag utforme en analyse som nøyaktig viser og pålitelig kvantifiserer en fenotype av interesse er en stor flaskehals i HC screening prosessen.
Mange skjermer er utført i mammalske celler ved hjelp av ulike RNAi biblioteker, som alle lider av off-target effekter, begrenset genet tie effektivitet og ufullstendig genomet dekning. Dermed bibliotekene må gjøres som er mer spesifikke, potent og har bedre dekning. Det arbeides med å lage slike det er håpet slike bestrebelser vil øke reproduserbarheten av HT / HC scre no treff.
En begrensning av mange store celle baserte skjermer er at de er utført i neuroblastom celler fordi de kan være genetisk manipulert og kultivert til store tall med relativ letthet. Imidlertid er relevansen av 'hits' identifisert i ex vivo cellekultur modeller til in vivo fungere tvilsom, spesielt ettersom hjernen består av høyt spesialiserte celletyper som danner et tett og komplisert nettverk av synaptiske forbindelser til å fungere som en svært integrert enhet. Som en konsekvens, er det vanlig at treffer identifiseres ved hjelp av screening tilnærmingen beskrevet ovenfor, er validert i sekundære skjermer bruke ekstra teknikker og i flere fysiologiske relevante modeller 39. For å forbedre oversettelsen av hits avdekket under HCS, mer representativt og sofistikerte modeller, slik som primær cellene og differensierte stamceller eller co-kulturen systemer må utvikles og tilpasses for HT / HC tilnærminger.
ntent "> Med en kombinasjon av automatiserte celledyrking og HC bildebehandling kan man raskt få ny innsikt i hvordan nerveceller funksjon og bestemme hvilke veier er viktig for sykdomsutvikling. kombinere HCS / HTS data med informasjon generert fra andre" omics "nærmer seg, vil det da være mulig å konstruere en systembiologi oversikt over hjernens sykdommer, og dermed tilrettelegge for terapeutisk utvikling.The authors have nothing to disclose.
Vi takker Hamilton programmerere og spesialister for videre støtte og Eva Blaas for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av to NWO Investeringstilskudd (911-07-031 og 40-00506-98-10011), The Prinses Beatrix Fonds Wetenschapsprijs 2009 og Neuroscience Campus Amsterdam, SJ er støttet av Ti-Pharma: T5-207.
Name of reagent | Company | Catalogue Number |
AI.CELLHOST | HAMILTON | http://www.hamiltonrobotics.com/en-uk/applications/cellomics/ |
OPTI-MEM | INVITROGEN | 31985-054 |
RETINOIC ACID | SIGMA-ALDRICH | R2625 |
OMNITRAY PLATES | NUNC | 465219 |
96 WELL CULTURE PLATES | GRENIER | 655086 |
DJ1 N20 ANTIBODY | SANTA CRUZ | SC27004 |
BETA-III TUBULIN ANTIBODY | SIGMA-ALDRICH | T3952 |
MITOTRACKER CMXROS | INVITROGEN | M-7512 |
HOECHST-33342 | INVITROGEN | H1399 |
HYDROGEN PEROXIDE | SIGMA-ALDRICH | 216763-100ML |
TRYPSIN | INVITROGEN | 25050014 |
DULBECCO’S PHOSPHATE BUFFERED SALINE | INVITROGEN | 14190086 |
PROMEGA WIZARD MAGNESIL TFX | PROMEGA | A2380 |
SHRNA CLONES | OPEN BIOSYSTEMS | http://www.openbiosystems.com/RNAi/shRNALibraries/ TRCLibraryDetails/ |
CELLOMICS BIOAPPLICATIONS | THERMO-FISHER | http://www.thermo.com/hcs |