מדידה של Cytosolic Ca 2 + ב lymphatics כויץ מבודד
Summary
אנחנו מציגים גישה להעריך את Ca cytosolic<sup> 2 +</sup> ריכוז lymphatics מבודדים ללמוד Ca<sup> 2 +</sup> תלויי Ca<sup> 2 +</sup>-רגישות מנגנוני התכווצות שריר חלק הלימפה.
Abstract
כלי הלימפה מהווים מערכת תחבורה רב תכליתיים המקיימת הומאוסטזיס נוזל, שומנים מספקת כדי זרימת המרכזית, ופועל כמערכת מעקב עבור אנטיגנים מזיקים, אופטימיזציה חסינות הרירית ונרכשת 1. לימפה נוצר מן נוזל interstitial שנכנס עיוורת הסתיימה lymphatics הראשוני, ולאחר מכן מועבר כנגד מפל הלחץ lymphatics איסוף גדול יותר. לימפטי כל איסוף מורכב מסדרה של קטעים בשם lymphangions, מופרדים על ידי שסתומים המונעים backflow הטוחנת. Lymphangion כל בעל מחזור התכווצות המניע הלימפה נגד הפרש לחצים לקראת מחזור המרכזי 2. דפוס זה התכווצות phasic משול מחזור הלב, עם סיסטולי ודיאסטולי שלבים, ועם 4 בתדר נמוך התכווצות. בנוסף, שריר חלק הלימפה יוצרת צליל ומציג התכווצות התרחבות myogenic ואניn בתגובה עליות וירידות בלחץ luminal, בהתאמה 5. היברידית של המנגנונים המולקולריים התומכות הן contractility phasic טוניק של lymphatics מוצעים כך.
התכווצות של שריר חלק מוסדר בדרך כלל על ידי cytosolic Ca 2 + ריכוז ([Ca 2 +] i) בתוספת רגישות Ca 2 +, האלמנטים כויץ בתגובה לשינויים בסביבה המקיפה את תא 6. [Ca 2 +] i נקבעת על ידי שילוב של תנועת Ca 2 + דרך הממברנה הפלסמטית ליגנד או מתח מגודרת Ca 2 + ערוצים שחרור ספיגת של Ca 2 + מחנויות פנימי. Cytosolic Ca 2 + נקשר calmodulin ומפעיל אנזימים כגון שרשרת אור שרירן (MLC) קינאז (MLCK), אשר בתורו phosphorylates MLC המוביל להתכווצות אקטין שרירן בתיווך 8. עם זאת, הרגישות של מסלול זה Ca <sup> 2 + יכול להיות מוסדר על ידי phosphatase MLC (MLCP) 9. פעילות MLCP מוסדר על ידי Rho קינאז (רוק) לבין מעכב phosphatase שרירן חלבון למדד 17.
כאן, אנו מציגים שיטה להערכת שינויים [Ca 2 +] i לאורך זמן, lymphatics מבודד perfused כדי ללמוד Ca 2 + תלויות Ca 2 + ו-רגישות מנגנוני התכווצות שריר חלק הלימפה. שימוש מבודד mesenteric עכברוש lymphatics איסוף למדנו למתוח-Induced שינויים [Ca 2 +] i ו התכווצות בפעילות. המודל הלימפה מבודד מציע את היתרון הזה, הלחץ הזרימה, את ההרכב הכימי של הפתרון אמבטיה ניתן לשלוט בחוזקה. [Ca 2 +] i נקבע על ידי טעינת lymphatics עם ratiometric, Ca 2 + מחייב לצבוע Fura-2. מחקרים אלה יספקו גישה חדשה לבעיה רחבה יותר של חקר המנגנונים המולקולריים שונים המווסתים phasicהתכווצויות לעומת התכווצות בשריר טוניק הלימפה חלקה.
Protocol
Discussion
שילוב הרומן של שיטות הועסק ללמוד מהותי שאיבה של כלי הלימפה. היכולת למדוד בו זמנית שינויים [Ca 2 +] i ו בקוטר lymphatics שאיבה יאפשר מחקרים על התרומה היחסית של Ca 2 + תלויות Ca 2 + ו-רגישות מסלולי איתות במנגנון הכולל המסדירים את מחזור הלימפה התכווצות.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| 1. Ringer 5x Stock | |||
| Company | Catalog Number | Amount | |
| Sodium Chloride | EMD | SX0420-3 | 35 g |
| Potassium Chloride | J.T. Baker | 3040 | 1.75 g |
| Calcium Chloride | Sigma | C-3881 | 1.47 g |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M-9397 | 1.44 g |
| Sterile Filtered Water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C | |||
| 2. MOPS buffer | |||
| Chemical | Company | Catalog Number | Amount |
| MOPS | Sigma | M3183 | 125.6 g |
| Sterile Filtered Water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Sterile filter into autoclaved bottles and stores at 4 °C | |||
| 3. Albumin Physiological Salt Solution (APSS) | |||
| Chemical | Company | Catalog Number | Amount |
| Ringer stock (5x) | N/A | N/A | 200 mL |
| Mops Buffer | N/A | N/A | 5 mL |
| Sodium Phosphate | Sigma | S-9638 | 0.168 g |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P5280 | 0.22 g |
| EDTA sodium salt | Sigma | ED2SS | 0.0074 g |
| Glucose | Sigma | G7528 | 0.901 g |
| Albumin, Bovine | USB | 10856 | 10 g |
| Sterile Filtered Water | N/A | N/A | Bring to 1 L |
| Adjust pH to 7.4 at 37° C, then sterile filter into autoclaved bottles and store at 4 °C. |
Table 1. Specific Reagents Used. Store all at 4 °C.
References
- Chakraborty, S. Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1207, 94-94 (2010).
- Zawieja, D. Lymphatic biology and the microcirculation: past, present and future. Microcirculation. 12, 141-141 (2005).
- Benoit, J. N., Zawieja, D. C., Goodman, A. H., Granger, H. J. Characterization of intact mesenteric lymphatic pump and its responsiveness to acute edemagenic stress. Am. J. Physiol. 257, H2059-H2059 (1989).
- Davis, M. J., Davis, A. M., Ku, C. W., Gashev, A. A. Myogenic constriction and dilation of isolated lymphatic vessels. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 296, H293-H293 (2009).
- Dougherty, P. J., Davis, M. J., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. Calcium sensitivity and cooperativity of permeabilized rat mesenteric lymphatics. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 294, R1524-R1524 (2008).
- Fay, F. S., Shlevin, H. H., Granger, W. C., Taylor, S. R. Aequorin luminescence during activation of single isolated smooth muscle cells. Nature. 280, 506-506 (1979).
- Wang, W. Inhibition of myosin light chain phosphorylation decreases rat mesenteric lymphatic contractile activity. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, 726-726 (2009).
- Karaki, H. Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle. Pharmacol. Rev. 49, 157-157 (1997).
- Ratz, P. H., Berg, K. M., Urban, N. H., Miner, A. S. Regulation of smooth muscle calcium sensitivity: KCl as a calcium-sensitizing stimulus. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 288, C769-C769 (2005).
- Somlyo, A. P., Somlyo, A. V. Ca2+ sensitivity of smooth muscle and nonmuscle myosin II: modulated by G proteins, kinases, and myosin phosphatase. Physiol. Rev. 83, 1325-1325 (2003).
- Souza-Smith, F. M., Kurtz, K. M., Molina, P. E., Breslin, J. W. Adaptation of mesenteric collecting lymphatic pump function following acute alcohol intoxication. Microcirculation. 17, 514-514 (2010).
- Breslin, J. W., Yuan, S. Y., Wu, M. H. VEGF-C alters barrier function of cultured lymphatic endothelial cells through a VEGFR-3-dependent mechanism. Lymphat. Res. Biol. 5, 105-105 (2007).
- Shirasawa, Y., Benoit, J. N. Stretch-induced calcium sensitization of rat lymphatic smooth muscle. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 285, H2573-H2573 (2003).
- Imtiaz, M. S. Pacemaking through Ca2+ stores interacting as coupled oscillators via membrane depolarization. Biophys. J. 92, 3843-3843 (2007).
- Muller, J. M., Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M. Changes in coronary endothelial cell Ca2+ concentration during shear stress- and agonist-induced vasodilation. Am. J. Physiol. 276, 1706-1706 (1999).
- Ferrusi, I., Zhao, J., van Helden, D., von der Weid, P. Y. Cyclopiazonic acid decreases spontaneous transient depolarizations in guinea pig mesenteric lymphatic vessels in endothelium-dependent and -independent. 286, H2287-H2287 (2004).
