1. De fabricação de microchips SU8 fabricação mestre. Para obter canais microfluídicos de 40 mM de altura, revestimento de spin SU8-50 (Microchem Corp) em um wafer de Si a 3000 rpm por 30 s. Bake suave em uma placa de aquecimento a 65 ° C por 5 minutos e 95 ° C por 30 minutos para evaporar o solvente e densificar o filme. Após o arrefecimento, expor o SU8 resistir com 360-440 nm de radiação a 300 mJ / 2, sob a máscara apropriada. Após a exposição, assar o wafer de 65 ° C por 2 minutos e 95 ° C por 4 minutos. Após o resfriamento, desenvolver as áreas não expostas (CE Micrpoposit solvente, Chestech) por 5 minutos, com agitação. 5 Use fresco CE solvente para lavar o wafer e seque-a com gás para gerar uma superfície limpa. Tratar o wafer com lavagens hexano e metanol. Completar o processo de fabricação SU8 mestre com uma etapa final de evaporação tricloro (1,1,2,2-perfluoocytl) silano na superfície (em um dessecador por 40 minutos). PDMS Curing, cortar e furar. A forma estruturada substratos microfluídicos, nós misturamos Sylgard 184 (Dow Corning) em uma razão de 10:1 (w / w) de resina para reticulador e em seguida despeje sobre o mestre. Degas em um dessecador, e depois curar o dispositivo (camada superior) para uma hora a 65 ° C. Corte o PDMS curado e retire-a do mestre. Criar espaços de acesso para tubos fluídico usando uma biópsia. Cure outra camada de PDMS (8 g da resina uniformemente distribuído em uma placa de Petri 10×10 cm) por 20 minutos a 65 ° C. Coloque a camada de preparado no topo da camada inferior e depois curar durante a noite a 65 ° C. Descasque as fichas da placa de Petri e dados para uso. 2. Montagem experimental Configuração microfluídicos Preencha seringas (plástico ou vidro de Beckton, Dickinson and Company ou de SGE Analytical Science) com as soluções necessárias, garantindo que não haja bolhas de ar permanecem em todas as partes do tubo. Para a geração de gotas duas fases são usados. O aquoso (disperso) PHAse contém os reagentes de interesse (por exemplo, uma suspensão de células em meio de crescimento, ou uma solução de fluoróforos molecular). A fase de petróleo, que neste caso atua como a fase contínua, geralmente é formado a partir de uma mistura de óleo e tensoativo, por exemplo, surfactante Raindance 2% (Raindance Technologies) em óleo fluorados (3M Líquido Fluorinert Eletrônico FC-40), ou 2% Span 80 (Croda) em óleo mineral. Fit tubulação (tubos de polietileno, Harvard Apparatus) do mesmo diâmetro interno, como as pontas de agulha de seringa em uma extremidade para as agulhas. A tubulação deve ser cortada no comprimento mais curto possível para minimizar o fluxo de instabilidades devido a perturbações vibracionais. Conecte as outras extremidades do tubo diretamente para os buracos perfurados no substrato PDMS. Soluções mais complexas, tais como o uso de portas capilar de sílica ou conectores (por exemplo Nanoports Upchurch) também podem ser implementadas para uma interface mais robusta entre o dispositivo ea tubulação microfluídicos. Ligue a saídaporta do chip para tubulação e direta em um coletor (para recolha de resíduos ou de processamento de analito mais). Monte as seringas em uma bomba de seringa (por exemplo, PHD 4400 Hpsi bombas de seringa programáveis, Harvard Apparatus) e definir a infusão desejada vazão para cada fase (geralmente da ordem de microlitros por minuto). A proporção mínima de óleo / aquosa de caudais de 1 Recomenda-se evitar molhar do PDMS pela fase aquosa, o que levaria a formação de gotículas instável (dependendo da geometria do dispositivo). Pela mesma razão, também é recomendada para o primeiro lave a fase de óleo por si só, através de qualquer canais microfluídicos, antes da introdução da fase aquosa. A configuração final utilizada para a experimentos aqui é ilustrada na Figura 2a. Configuração do sistema óptico A sonda pequenos volumes (até um picolitros poucos) dentro dos canais microfluídicos com resolução espacial e temporal de alto uso de um microscópio confocal (com automated capacidade de posicionamento submicron). Use solúvel em água, moléculas fluorescentes com rendimentos elevados, idealmente quântica. Excite as moléculas usando um sistema operacional de laser no comprimento de onda que corresponde a absorção do fluoróforo envolvidos. Por exemplo, moléculas fluorescentes comuns, tais como fluoresceína isotiocianato-5 (FITC) e Alexa Fluor-488 pode ser eficientemente animado usando um laser de diodo 488 nm (por exemplo, PicoQuant Gmbh, LDH-PC-485). Moléculas fluorescentes, como Texas Red ou Allophycocyanin (APC) pode ser eficientemente saiu a 633 nm usando um He / Ne laser (por exemplo, Newport R-31425). Use lasers pulsados operando a taxas de repetição de várias MHz (com separações de pulso várias ns) e fluoróforos com propriedades vida suficientemente diferenciado for Imaging Lifetime fluorescência (FLIM) experimentos. Use feixe de direção espelhos e óptica para controlar a altura do feixe, assim como direção do feixe. Use um espelho dicróico para refletir o feixe de laser para o objetivo lens. Se dois lasers são usados simultaneamente, uma banda dual-espelho dicróico pode ser instalado para permitir a reflexão dos dois feixes de laser (por exemplo, para 488 e 633 nm vigas de um espelho z488/633rdc Technology Corporation Chroma é ideal). Use uma corrigido ao infinito, alta abertura numérica (NA) objetiva do microscópio (ou seja, 60 x Olympus / 1.2 NA, imersão em água) para trazer a luz do laser para um foco apertado dentro de um canal microfluídicos. Ao trabalhar com microcanais de altura (> 100 mm) o objetivo deve ser usada adequadamente selecionados para garantir que a sua distância de trabalho efetivamente cobre a altura total do microcanal. Coletar fluorescência emitida pela amostra (dentro do canal microfluídicos) usando o mesmo objetivo NA alto e transmitidas através do mesmo espelho dicróico. Remova qualquer luz de excitação residual usando um único ou dual-band de emissão de filtro (por exemplo, um filtro de z488/633 Chroma Technology Corporation). O foco da emissio fluorescêncian em uma pinhole M 75 usando uma lente plano-convexa (por exemplo, 50,2 F; Newport Ltd.). Posição do pinhole no plano confocal da objetiva do microscópio. Use um outro espelho dicróico (por exemplo, 630dcxr, Chroma Technology Corporation) para dividir o sinal em dois detectores fluorescentes. Filtro da fluorescência refletida pelo espelho dicróico com um filtro de emissões (por exemplo, um filtro de hq540/80 m Chroma Technology Corporation) e focá-la com uma lente plano-convexa (por exemplo, f = 30,0, 25,4 mm id, Thorlabs) para o primeiro ( 'verde') detector. Para experimentos envolvendo um fluoróforo secundário filtro vermelho a fluorescência transmitida pelo espelho dicróico com outro filtro de emissões (por exemplo, um filtro de hq640lp Chroma Technology Corporation) e, em seguida, concentrar-lo com outra lente plano-convexa sobre o detector ('red') segundo. Use fotodiodos avalanche (por exemplo, AQR-141, EG & G, Perkin-Elmer) para a detecção de fótons de fluorescência. A configuração final é ilustrado na <strong> Figura 2b. 3. Gota geração e aquisição de dados Geração de métodos de gota Você pode usar duas configurações principais de microcanais para gerar gotículas: um fluxo de focagem ou entroncamento formato (Figura 3a e 3b) 6,7 Ambos os métodos são equivalentes, enquanto as gotas formadas são tão larga quanto a de microcanais em si.. Como resultado das forças de cisalhamento que surgem de usar essas geometrias para trazer os dois fluidos imiscíveis em conjunto e as instabilidades subseqüentes capilar que se desenvolvem na interface, gotículas monodisperso (tão pequeno como um femtoliters poucos) são gerados espontaneamente. Você pode encapsular reagentes de diferentes maneiras: os reagentes podem ser preparadas e misturadas off chip para a mistura desejada / concentração, ou eles podem ser levados separadamente para o chip e, em seguida, combinados antes da formação de gotículas (Figura 3c). Esteúltimo método prevê maior flexibilidade, já que misturas / concentrações podem ser modificados por simplesmente ajustar a relação de caudais. Note-se que, para encapsulamento de células, a suspensão celular na seringa deve ser agitada para evitar a condensação das células sobre a escala de tempo do experimento. Aquisição de dados de fluorescência. Par o sinal eletrônico do detector de fotodiodo avalanche (descrito no 2.2.12) para um dispositivo DAQ multifuncional para registro de dados (por exemplo, um PCI 6602, National Instruments), rodando em um computador pessoal. Para experimentos FLIM ligar os detectores a uma contagem de fótons correlacionados no tempo único (TCSPC) cartão (por exemplo TimeHarp 100, PicoQuant GmbH) rodando em um PC separado. Este cartão permite que os dados da vida de fluorescência de ser obtida utilizando uma metodologia TCSPC: cada fóton detectado fluorescente está correlacionada com um pulso de laser incidente e, portanto, cada fóton emitido fluorescentes é atribuído um tempo de atraso. Estes dadospodem ser montados em uma curva de decaimento simples ou multi-exponencial para obter uma estimativa do coeficiente de taxa de fluoróforo / s radiativa / s. Deconvolute os dados brutos com a função de resposta do instrumento (IRF) do detector: esta é obtida usando uma baixa concentração da solução Auramina-O (que exibe uma vida de fluorescência de um picossegundos poucos) 8. 4. Reconhecimento celular e mapeamento da mistura dentro de gotículas Reconhecimento celular e mapeamento da mistura dentro de gotículas Use Escherichia coli Top 10 estirpe para a experiência do ensaio de viabilidade. Cultura as células em Luria-Bertani caldo durante a noite e coincidir com a densidade óptica a 0,5 antes dos experimentos. Use 0,4 mM SYTO9 e um iodeto de propídio M para detectar a viabilidade das células. Ambos são DNA-intercalando corantes e sua intensidade de fluorescência aumenta em mais de 20 dobras ao se ligar ao DNA. SYTO9 é um corante fluorescente verde que está membrane permeável e iodeto de propídio é um corante vermelho fluorescente que é membrana impermeável. Assim, as células vivas fluorescência "verde", enquanto as células mortas exibem tanto 'verde' e 'vermelho' de emissões. Use a configuração introduzida em 2.2) para verde / vermelho detector de fluorescência. Usar um portátil, mini-agitador magnético (Utah Biodiesel Abastecimento, Utah) para agitar a suspensões de células dentro de uma seringa de 3mL Plastipak BD equipado com uma barra de agitação magnética 7 milímetros para evitar a sedimentação das células. Mapeamento de eventos de mistura usando FLIM O foco do volume sonda óptica a metade da altura de um microcanal ao longo da qual as gotas estão fluindo. Gotículas formam a partir de duas soluções aquosas (como na Figura 3-C), cada um contendo um fluoróforo (não interagindo) com diferentes características vidas fluorescente. Início de um lado do canal, realizar cada experimento ao longo de toda a largura do canal em intervalos de 1 mM. O canal edges pode ser facilmente identificado como a intensidade de fluorescência cai drasticamente uma vez que o feixe de laser é focalizado em sua proximidade. Implementar um algoritmo para diferenciar rajadas de sinal (associado com gotas) do ruído de fundo da fase de óleo e para estabelecer a duração de cada burst. Implementar um algoritmo para extrair o segundo tempo de atraso e valores de intensidade ao longo do comprimento de cada gota na largura especial onde o experimento foi realizado 9. Em seguida, use um algoritmo de Máxima Verossimilhança Estimator (MLE) para avaliar o tempo de vida de fluorescência para cada gota no experimento. 8 Média dos valores da vida para todas as gotículas no experimento, reduz o erro final do cálculo MLE (as gotículas mais sondado, o menor o erro). Uma vez que uma trajetória de vida foi obtida para cada largura, combine todas as trajetórias em um mapa 2D. Desde que cada valor da vida está associada a um particularlar mistura dos dois fluoróforos, uma concentração (ou mistura) mapa pode ser assim obtida. Opcionalmente, um mapa 3D da gota mistura poderia ser facilmente obtida mediante a repetição deste protocolo em diferentes posições ao longo da altura do canal microfluídicos. 5. A análise dos dados Reinterpretar os arquivos de dados experimentais-prima para a linguagem de computação apropriados para que eles possam ser analisados (arquivos de texto por exemplo, que contêm a variação das contagens de fótons ao longo do tempo, pode ser facilmente extraído em Matlab para processamento de dados e análise). Você pode ter que escrever códigos específicos para acessar os dados contidos em arquivos de experimentos mais complexos (tais como os de FLIM) ou para executar algoritmos MLE ou construir mapas 2D de padrões de mistura de trajetórias vida. 6. Resultados representante Reconhecimento das células Exemplos típicos da variation de contagens de fótons em função do tempo para os experimentos baseados em células são mostrados nas Figuras 4a e c, durante um período de 200 milissegundos. Importante o caldo Luria-Bertani (LB médio) atua como um fundo fracamente fluorescentes definição dos limites das gotículas, enquanto rajadas de fótons distintos, correspondendo à presença de células individuais, podem ser distinguidos em cima deste fundo. O fundo LB fluorescente é caracterizada por uma cerca de seção retangular (marcado pelas linhas vermelha e verde pontilhada). O máximo metade largura (FWHM) de rajadas fluorescentes resultantes da E. células coli é 30 vezes menor do que os eventos de fundo gota, o que é consistente com o comprimento relativo de gotas (40 microns, o que corresponde a um volume de 30 picolitros) e E. células coli (1,5-2,0 microns). 10 Com o dual channel detectarion sistema, a existência de células vivas ou células mortas pode ser distinguido a partir da análise dos canais verde e vermelho. Figuras 4 b e d mostram a distribuição de probabilidade descrevendo o número de células por gota. Mapeamento de eventos de mistura usando FLIM O tempo de vida de fluorescência molecular é uma propriedade intrínseca de um fluoróforo indivíduo que é afetado apenas pelo seu ambiente químico. Nesse sentido a sua medições podem ser usados para obter informações ambientais (tais como pH, temperatura, viscosidade e polaridade), com resolução superior e precisão do que o tempo integrado medições de fluorescência, que são dependentes de fatores experimentais (tais como a concentração, a intensidade de excitação e coleta de óptica eficiência). 9,11 Como apresentado em outros lugares, 8, é possível mapear os padrões de mistura dentro gotículas por meio de dois fluoróforos com different valores da vida. Em uma mistura contendo dois (não-interativas) espécies fluorescentes a decadência irá assumir uma forma biexponencial como é mostrado na equação 1: As vidas individuais são definidos como τ1 e τ2, ea amplitude de cada componente é dada por α1 e α2, respectivamente. O tempo médio de vida pode ser definida como segue: Onde β1 e β2 são a fração de cada componente e são definidos da seguinte forma: Como o volume da sonda é fixa e as gotas estão fluindo através dessa posição, a trajetória da vida valores ao longo do comprimento das gotículas em que a largura em particular pode ser assim obtida. A trajetória característica para uma largura particular, valores normais especificadosed entre 6000 gotas, pode ser observado na Figura 5a. Combinando as trajetórias ao longo de toda a largura do canal leva à formação de uma concentração em 2D (ou mistura) do mapa. Um resultado típico é apresentado na Figura 5b. Pela média dos resultados entre um grande número de gotas, o erro padrão dos resultados obtidos pode ser bastante reduzido (1% de erro padrão, com um intervalo de confiança de 95% para Figura 5a). O método de determinação da trajetória de vida pressupõe que todas as gotas são praticamente idênticos. Isto é provado ser muito correta por duas razões principais: se as gotas foram significativamente diferentes, as trajetórias da vida média obtida teria mais planas, perfis menos divergentes (e diferenças acentuadas ao longo da vida ao longo do comprimento das gotículas médias são consistentemente detectado). Além disso, os resultados são reprodutíveis, independentemente de o indivíduogotículas analisadas ou a quantidade de gotas utilizados nos cálculos 8. Figura fluxo do processo 1. Sobre a fabricação de chips microfluídicos. Figura 2 um diagrama), representando as bombas de seringa e seringas, ligado ao chip microfluídico para a formação de gotículas; b) Representação esquemática de uma configuração típica de um laser óptico 2-2 fluoróforo (verde e vermelho) de excitação e de detecção.. DC = Dichroic espelho, EM = emissão de filtro, L = Lens, PH = Pin Hole, APD = detector fotodiodo Avalanche. Figura 3 On-chip estratégias de formação de gotas: a) o fluxo de focagem de configuração; b) configuração entroncamento.. c) No encapsulamento de chips em droplets de duas originalmente separados reagentes aquosos. Figura 4 de leitura óptica de 0,2 s traços gravados para (a) mortos e (c) células vivas (taxas de fluxo de suspensão de células: 1 min mL -1, óleo: 2 min mL -1).. Cada sinal em forma de arco corresponde ao meio LB fracamente fluorescentes que forma a gota aquosa, com limites de gotículas marcados com linhas tracejadas. Sinais verdes representam sinais de leitura em 633 nm e comprimentos de onda vermelhos mais de 633 nm. Células são distinguidos pelo pico verticais decorrentes da corantes intercalantes de DNA. Distribuição de probabilidade para ocupação celulares dentro de gotículas único para (b) as células mortas e (d) células vivas. Figura 5 a) trajetória da vida típica média ao longo do comprimento de uma gota em uma largura particular;. B)Representação típica da combinação de todas as trajetórias média sondado ao longo da largura total das gotículas em uma vida em 2D (ou concentração, expressa em Str AF488% FITC /%) do mapa.
