Un protocolo para la detección y borrado en fase gaseosa radicales libres en el humo del cigarrillo Mainstream

1. Materiales Todos los disolventes utilizados en este trabajo fueron de grado reactivo. La trampa de la vuelta, incluyendo N-terc-butil-α-phenylnitrone (PBN) y la etiqueta de giro estándar de 2,2,6,6-tetrametil-1-piperinyoxyl (TEMPO) se obtuvieron de Sigma y se utilizaron tal como se suministra. Los antioxidantes de plantas se obtiene comercialmente a partir de Swanson EE.UU., Inc.. 2. Preparación del humo del cigarrillo y el análisis de los radicales libres Para introducir antioxidantes en el filtro, el pycnogenol antioxidantes y extracto de semillas de uva fueron disueltos en etanol al 95%, mientras que el licopeno se disolvió en acetona. Los volúmenes de disolventes fueron diferentes dependiendo de la solubilidad antioxidante. La cantidad de antioxidantes de 0,4 mg / filtro se utilizó. Que se revistieron con 10 mg de carbón activado. Para ello el carbón activado se agitó durante ~ 12 horas con la solución antioxidante en condiciones anaeróbicas, se filtra y se seca al vacío. </li> Los antioxidantes se introdujeron entonces en el filtro de acetato convencional (CA filtro). Para ello, el filtro se cortó en dos pedazos. La cubierta de plantas antioxidantes se inserta entre dos piezas del filtro y se envuelve con un trozo de cinta para formar un filtro – antioxidantes filtro sandwich (Fig. 1A). Este filtro combinado se unió posteriormente a las barras de cigarrillos que contengan tabaco. El control de filtro se realizó en la misma forma que el filtro antioxidante excepto que no se añadió antioxidante. Antes de la simulación de fumar, los cigarrillos de investigación fueron desempaquetado y se mantienen en un ambiente de humedad constante (20 ° C, 60% de humedad relativa) utilizando una solución saturada de NaBr por un mínimo de 2 días. Simulación de fumar para análisis de rutina se realizó a temperatura ambiente usando un dispositivo de fumar de un solo puerto que, como se muestra en la Fig. 1, consiste en un aspirador de agua o GAST DOA-P104-BN bomba de vacío / compresor de aire (Benton Harbor, Michigan) conectado con el giro que atrapanmontaje a través de un cruce con un extremo abierto. Bocanadas se llevaron a cabo conectando el extremo abierto que se mantuvo abierta entre calada y calada. El flujo de gas se comprobó mediante medidor de flujo y se fijó en ~ 2.2 SCFH = 17,5 ml / s mediante el ajuste de una válvula situada entre la bomba y el ano. Los cigarrillos se fumaban la investigación bajo la condición de volumen bocanada de 35 ml con una duración de 2 segundos repite cada 60 segundos, similar a 1. Simulación de fumar para la estimación cuantitativa de los radicales libres en fase gaseosa se llevó a cabo en conjunción con el sistema de captura de giro como se muestra en la fig. 1. Diez inhalaciones intensas (35 ml / puff) fueron tomadas por cada cigarrillo. Fase gaseosa de los radicales libres fueron recogidos por pasar la MCS a través de una plataforma de Cambridge filtro y se introduce en la solución de captura de giro (0,05 M PBN en benceno, 2,0 ml). Después de la última dosis, la solución de captura de burbujas se reajustó a su volumen inicial (2,0 ml) con el benceno mismo. Una alícuota fue trasladado en un 25 ~0 mm de largo, 3 mm de diámetro del tubo de vidrio sellado en un extremo. La solución de captura fue desoxigenada mediante un procedimiento de congelación y descongelación de la bomba. Que se congeló en nitrógeno líquido, y el vacío fue aplicado. Luego fue descongelado en atmósfera de argón, lo que permite burbujas de gas se escape, y se congela de nuevo. Después de este ciclo se repitió tres veces, el tubo se llama sellado al vacío y se utiliza en más medidas de ESR. Este paso es necesario porque el oxígeno, que es muy soluble en benceno, amplía las líneas de ESR de radicales orgánicos. Desoxigenación mejora considerablemente la relación señal-ruido. X-Band ESR espectros se registraron en un espectrómetro Bruker EMX a una frecuencia de 9,34 GHz en condiciones normales. Los ajustes del espectrómetro utilizado en la mayoría de los experimentos fueron: el jardín central 3312.5G, escanear ancho 80G, la modulación de amplitud 0,5 G, la constante de tiempo 82 microsegundos, tiempo de exploración 40 seg. Los aductos trampa de giro son relativamente estables en las condiciones del experimento, que en algunos casos reqle pedirá otra vez 25 acumulaciones, que normalmente se ~ 20 min. Sin embargo, después de 12 horas la intensidad de las señales de ESR en una solución de benceno disminuye en un factor de ~ 5. Para cuantificar la concentración de la aducción de trampas, sus iniciales de la primera derivada del espectro de ESR se ha integrado. El espectro de absorción resultante muestra un fondo singlete amplio, muy probablemente debido a los productos de hollín / alquitrán contenidos en el humo. Después de la sustracción de estos antecedentes, el trío separado del aducto de captura se ha integrado una vez más (Fig. 2). 3. Resultados representante La mayoría de los radicales libres en la quema de cigarrillos de producción de humo (fase gas) son instantáneas e inestable. Con el fin de observar estos radicales una técnica trampa de spin se emplea. Captura fase gaseosa de los radicales libres por su transformación en un aducto de giro que es más estable y puede ser detectado por ESR (Fig. 1). En el presente estudio, la solución de spin-trampa de 0,05M PBN se utilizó para recoger el gas de humo fase de radicales libres, que son una mezcla de radicales de oxígeno, y se centra en carbono que son difíciles de separar 15. En nuestro caso, sin embargo, las constantes hiperfinos observa la división de un N = 13,7 g y 1,95 g H = son muy similares a los valores correspondientes para la captura de aductos de alcoxilo los radicales libres (Romanos) 2, lo que sugiere que son el producto principal. Hemos demostrado que las señales débiles ESR y reproducibilidad baja observada en nuestras mediciones iniciales (Fig. 2) se debieron a la humedad en el flujo de humo. Para resolver este problema, hemos añadido un nitrógeno líquido (LN2) trampa entre el filtro de Cambridge y la solución spin trampa. La LN 2 trampa elimina el agua del flujo de MCS de congelación rápida y la captura en la pared interior del tubo de vidrio. Esto mejoró las señales de ESR y ha permitido resultados altamente reproducibles (Fig. 3). La cantidad de radicales libres atrapados se determinó utilizando unmuestra de referencia. Para las muestras de control sin antioxidantes, la concentración de benceno en el aducto típicas estimadas por comparación de su espectro integral doble con un espectro integral doble de concentración conocida de TEMPO fue de 1,24 M (Fig. 2). Dado que la cantidad de aire que pasa a través de cada cigarrillo se fuma fue de ~ 350 ml, lo que da una estimación de la concentración de radicales libres en la fase gaseosa de MCS de 7.1X10 ~ -9 M, y un número total de radicales atrapados de la fase gaseosa de un cigarrillo entero de 1.5×10 ~ 15. Una estimación de la cantidad total de los radicales libres en el humo de un cigarrillo entero, incluyendo tanto el gas y la fase de partículas, fue ~ 10 16 radicales libres 9. Los diferentes niveles del efecto de barrido de la planta de antioxidantes sobre los radicales libres en fase gaseosa del humo del cigarrillo corriente principal se observaron. Sus tasas de recolección de residuos se presentan en la figura. 4. Licopeno y extracto de semilla de uva mostraron las tasas más altas mientras que los bajoser tasa se observó para el Pycnogenol (Fig. 4). Figura 1. Un diagrama de un mejor diseño de simulación de fumar para la recogida de fase gas-radicales libres en el humo del cigarrillo convencional (MCS) con trampa de spin. MCS fue dibujado por un aspirador de agua a través de CA filtro, filtro de Cambridge (filtro amarillo) y pasa a través de una trampa de nitrógeno líquido para eliminar el H 2 O. Los productos en fase gaseosa, finalmente fue a girar trampa y burbujea a través de la solución trampa giro. Antioxidantes planta fue colocada entre dos piezas de filtros de acetato convencional (ampliada en el círculo A) conectado a los cigarrillos para eliminar los radicales libres en el MCS. Figura 2. Una estimación cuantitativa de la concentración de aducto spin-captura en benceno requiere restar una señal de fondo amplio de la primera integraciónl espectro. Los parámetros de interacción hiperfina para el aducto spin-trampas son una H = 1,95 g, un N = 13,7 g. Figura 3. Pasando a través de LN2 trampa mejora sustancialmente la calidad de las señales de ESR obtenidos por spin-captura de MCS. Figura 4. Efecto de los antioxidantes naturales de la concentración de radicales libres en el MCS. La intensidad relativa de la señal son: control – 100%, el Pycnogenol – 55%, extracto de semilla de uva – 12%, el licopeno – un 10%.