Протокол обнаружения и очистки газовой фазе Свободные радикалы в дыме сигарет

1. Материалы Все растворители, используемые в этой работе были реагента класса. Спиновых ловушек, в том числе N-трет-бутил-α-phenylnitrone (PBN) и стандартный ярлык спина 2,2,6,6-тетраметил-1-piperinyoxyl (TEMPO) были получены от Sigma и были использованы при поставке. Завод антиоксидантов были получены коммерчески от Свонсон, Inc США. 2. Подготовка сигаретного дыма и анализ свободных радикалов Внести антиоксидантов в фильтр, Пикногенол антиоксиданты и экстракт виноградных косточек были сначала растворяют в 95% этанола, в то время как ликопин растворяется в ацетоне. Растворитель объемы были различными в зависимости от антиоксидант растворимости. Количество антиоксидантов в 0,4 мг / фильтр был использован. Затем они были покрыты 10 мг активированного угля. Для этой цели активированный уголь перемешивали в течение ~ 12 часов с антиоксидантными решения в анаэробных условиях, фильтруют и высушивают в вакууме. </lя> Антиоксиданты были затем введены в обычных фильтра ацетат (CA фильтр). Для этого фильтр был разрезан на две части. Покрытием завода антиоксидантов были вставлены между двумя кусками фильтра, оборачивают кусок ленты для формирования фильтра – антиоксидант-фильтр сэндвич (рис. 1А). Этот комбинированный фильтр был впоследствии прилагается к сигарете стержни, содержащие табак. Фильтр контроля было сделано тем же способом, как антиоксидант, кроме фильтра не был добавлен антиоксидант. До курения моделирования, исследования сигареты будут распакованы и хранится в постоянной влажности окружающей среды (20 ° C, относительная влажность 60%) с помощью насыщенного раствора NaBr в течение минимум 2 дня. Курение моделирования для рутинного анализа проводился при комнатной температуре, используя один порт устройства для курения, которое, как показано на рис.1, состоит из аспиратора воды или GAST DOA-P104-BN вакуумный насос / компрессор (Бентон-Харбор, Мичиган), связанные спин-захватасборки через Т-образного перекрестка с одного конца открытым. Пуфы проводились путем подключения открытый конец которой оставался открытым между затяжками. Газа было проверено расходомер и установлена ​​на уровне ~ 2,2 SCFH = 17,5 мл / с, регулируя клапан расположен между насосом и вентиляционное отверстие. Исследования сигареты копченой при условии слоеного объеме 35 мл на протяжении 2 секунд каждые 60 секунд, аналогично 1. Курение моделирования для количественной оценки газофазного свободных радикалов была выполнена в сочетании с системой захвата спин, как показано на рис. 1. Десять интенсивной клубы (35 мл / слоеного) были взяты для каждой сигаретой. В газовой фазе свободных радикалов были собраны путем пропускания через MCS Кембридже фильтр площадку, а затем в раствор вводят спина захвата (0,05 М PBN в бензол, 2,0 мл). После последней затяжки, пузырилась захвата решением был скорректирован до первоначального объема (2,0 мл) с тем же бензола. Аликвоту был переведен в ~ 250 мм, 3 мм ID стеклянную трубку запечатаны с одного конца. Улавливания раствора венозная использованием замораживания-оттаивания насоса процедуры. Это было заморожено в жидком азоте и вакуум применяется. Тогда это было талых в атмосфере аргона, что позволяет ловушке пузырьков газа бежать, и замороженные снова. После этого цикл повторяется три раза, трубки запаянные в вакууме, а используется в дальнейших измерениях ЭПР. Этот шаг необходим, потому что кислород, который хорошо растворим в бензоле, расширяет линий ЭПР органических радикалов. Дезоксигенирования значительно улучшает отношение сигнал-шум. X-Band спектрах ЭПР регистрировали на спектрометре Bruker EMX на частоте 9,34 ГГц при стандартных условиях. Спектрометр настройки, используемые в большинстве экспериментов были: центр поля 3312.5G, сканирование шириной 80G, амплитудной модуляции 0.5G, постоянной времени 82 мкс, время сканирования 40 сек. Аддуктов спиновых ловушек являются относительно стабильными в условиях эксперимента, который в некоторых случаях REQuired 25 скоплений, которые, как правило взяла ~ 20 мин. Однако, после 12 часов интенсивность сигналов ЭПР в растворе бензола снизилась на ~ 5 раз. Для количественной оценки концентрации захвата аддукт, его начальная первой производной спектра ЭПР была интегрирована. В результате поглощения спектра показывает широкий фон синглет, скорее всего, из-за сажи / смолы, содержащиеся в дыме. После вычитания этого фона отделен тройка захвата аддукт был интегрирован еще один раз (рис. 2). 3. Представитель Результаты Большинство свободных радикалов в горящей сигаретой производства дыма (газовая фаза) являются мгновенными и нестабильной. Для того чтобы наблюдать эти радикалы техника спин ловушка работает. Она захватывает газофазных свободные радикалы, превращая их в спину аддукт которая является более стабильной и может быть обнаружен с помощью метода ЭПР (рис.1). В настоящем исследовании спин-ловушку раствора 0,05М PBN была использована для сбора дыма газовой фазе свободных радикалов, которые являются смесью кислорода и углерода в центре радикалов, которые трудно отделить 15. В нашем случае, однако, наблюдается расщепление сверхтонкой константы N = 13.7G и H = 1.95G очень похожи на соответствующие значения для улавливания аддуктов алкоксил свободных радикалов (RO.) 2, предполагая, что они являются основным продуктом. Мы показали, что слабые сигналы ЭПР и низкая воспроизводимость наблюдается в наших первоначальных измерений (рис. 2) из-за влаги в дыму потока. Чтобы решить эту проблему, мы добавили жидкого азота (LN2) ловушке между Кембридже фильтр и решение спин ловушку. Л. Н. 2 ловушки удалить воду из MCS потока быстрого замораживания, и взял его на внутренней стенке стеклянной трубки. Это значительно улучшило сигналы ЭПР и позволило очень воспроизводимые результаты (рис. 3). Количество захваченных свободные радикалы определяли с помощьюэталонного образца. Для контрольных образцов без антиоксидантов, типичные концентрации аддукта в бензоле оценкам путем сравнения его двойной интеграл спектр с двойной интеграл спектра для известной концентрацией TEMPO был 1,24 мкм (рис.2). Так как количество воздуха проходит через каждую сигарету во время курения составлял ~ 350 мл, это дает оценку концентрации свободных радикалов в газовой фазе MCS из ~ 7.1X10 -9 М, а общее число захваченных радикалов из газовой фазы целой сигареты ~ 1.5X10 15. Оценка общего количества свободных радикалов в дыму сигарет целом, в том числе и газа и твердых частиц фазы, составляет ~ 10 16 свободных радикалов 9. Различные уровни очистки эффект растительных антиоксидантов на газовой фазы свободных радикалов в основной поток табачного дыма не наблюдалось. Их очистка ставки были представлены на рис. 4. Ликопин и экстракт косточек винограда показала самые высокие темпы в то время как низкийэ ставка наблюдалась Пикногенол (рис.4). Рисунок 1. Диаграмма улучшенной конструкции моделирования курения для сбора газовой фазе свободных радикалов в дыме сигарет (МКС) с использованием спиновых ловушек. MCS было обращено на воду аспиратора через CA фильтр, то Кембридж фильтра (желтый фильтр) и пропускается через отделитель жидкости азотом для удаления H 2 O. Газообразных продуктов, наконец, отправился в спину ловушку и пропускается через раствор ловушку спина. Завод антиоксидант был помещен между двумя частями обычных фильтров ацетат (расширенный в кружке), подключенных к сигарете, чтобы убрать мусор свободных радикалов в MCS. Рисунок 2. Количественную оценку для захвата спин-аддуктов концентрации бензола требует вычитания широкий сигнал фон от первого интеграциил спектра. Сверхтонкого расщепления параметров спин-захвата аддукта являются H = 1,95 G, N = 13.7G. Рисунок 3. Проходя через LN2 ловушку существенно улучшает качество сигнала ЭПР получил спин-захвата MCS. Рисунок 4. Влияние природных антиоксидантов на концентрации свободных радикалов в MCS. Относительной интенсивности сигнала: контроль – 100%, Пикногенол – 55%, экстракт косточек винограда – 12%, ликопин – 10%.