高秩序のナノシートにペプトイドポリマーおよびそれらの自己組織化の固相Submonomer合成

1。 Polypeptoidsの固相Submonomerの合成固相合成（SPS）は、直接そのようなポリマー樹脂ビーズのような不活性固体支持体上の配列特異的な生体高分子の段階的合成するために使用される一般的な技術、である。高いカップリング収率と過剰反応物の除去の容易さは、SPSの主要な利点です。樹脂にカップリング反応後、過剰の試薬は単に排出され、ビーズは次の反応段階の準備をして洗浄される。最終的な合成反応の後、完全長のオリゴマーは、樹脂から切断され、液相の物質をさらに研究することができる。ここで、我々は、配列特異的ペプトイドのポリマーを生成するためにSPSの手順を適応させる。 セットアップ：手動ペプトイドの合成のすべてのステップは、使い捨て、ポリプロピレン（PP）フリットカートリッジまたは3方活栓を搭載したフリットガラス反応容器で行うことができる。ドラフト内ですべての操作を実行します。 gのインキュベーションのための小娘の容器やプラスチック製のカートリッジ、適切な混合のためのソリューション優しくバブルへの窒素供給に片腕を接続する。また、使い捨てのカートリッジ内の反応インキュベーションのために、ロータリーシェーカー上でキャップと場所によってカートリッジの両端をシール。反応混合物または洗浄を排出するため、廃棄物のトラップを介して真空を収容するために接続する。容器は粗いフリットでフリット化されるべきである。ガラス容器の壁に付着ビーズを避けるために、ガラス製反応容器にシリコーンで覆う。ジクロロエタンの5％ジクロロジメチルシラン（v / v）の溶液を調製します。 siliconizingソリューションを持つトップへ清潔で乾燥した反応容器を埋める、ドレインし、30分間放置します。メタノールで一度してDCEに一度容器を洗って。 siliconizingソリューションを再利用することができますので、保存する必要があります。どちらの空気が乾燥または振り落とす余分なソリューションをして栓を除去した後、乾燥するまで、ガラスを焼く。樹脂を追加する前に、クールな反応容器。 Rinkアミド再物100mg（0.06ミリモル）を追加フリット反応容器への罪。ジメチルホルムアミド2mLのジメチルホルムアミド（DMF）を追加することにより、樹脂を膨潤する。振ったり、10分間吹き込むことにより攪拌。膨潤した樹脂を分離するために真空によってソリューションを排出。 Fmoc基を脱保護するためにDMF中20％4 – メチルピペリジンを1mL（V / V）を追加します。 2分とドレインのために振とうする。 12分のインキュベーションを繰り返します。 、DMF 2 mLを加える15秒攪拌、および排水によって樹脂を洗浄します。 3倍繰り返します。 Bromoacetylation：DMF中0.6Mのブロモ酢酸（0.6ミリモル）を1 mL及びN、N' -ジイソプロピルカルボジイミド（0.93当量、0.56ミリモル）を86μLを追加。 30分間穏やかバブリングでインキュベートし、排出し、DMF 2 mLの（4 ×繰り返し）ですすいでください。 変位：N -メチルピロリジノンの1-2 Mのアミンの1 mLを追加。 30〜120分間バブリングでインキュベートし、排出し、DMF（4 × 2mL）ですすいでください。 submonomerのサイクルを繰り返すことによって、ペプトイドチェーンの成長を続けて、ステップ1.5（bromoacetylation）および1.6（displacement）を。 最終的な変位が終了した後、DMF 2 mLの（4 ×繰り返し）で洗い流した後、ジクロロメタン2mLの（3倍繰り返す）。キャップと切断されるまで反応容器を格納する。 合成（オプション）で一時停止：ペプトイド合成中に一時停止するには、置換反応を終了し、1.8に進みます。ペプトイド鎖を成長を続けるために、再び腫れ乾燥した樹脂（ステップ1.2）とsubmonomerサイクル（ステップ1.5および1.6）を繰り返すことにより、合成を再起動します。樹脂-ペプトイド複合体は、環状ケトピペラジン側の製品を形成する可能性があるため、樹脂を乾燥させ、第2変位を除く任意の変位後に保存することができます。 複数の同時合成のために、固相抽出の真空マニホールドは、効率を最大化することをお勧めします。ペプトイド合成はまた、Aapptecアペックス396、CEMリバティのマイクロ波シンセサイザとタンパク質のテクノのような市販のペプチド合成機で適切にプログラミングする方法、によって自動化することができますlogies株式会社プレリュードシンセサイザー。 2。開裂し、側鎖の脱保護 20mLのシンチレーションガラスバイアルに乾燥樹脂のすべてを譲渡する。 フード内部の作業、および適切な個人用保護具を使用して、しっかりとシンチレーションガラスバイアルとキャップにトリフルオロ酢酸（TFA）開裂のカクテル1（例えば95％水溶液。TFA、議論を参照してください）4 mLを加え。室温で2時間〜10分間振盪する（議論を参照）。 新しい、事前に秤量した20mlのシンチレーションガラスバイアルに使い捨て、PPフリットカートリッジを通して樹脂をフィルタリングすることにより、TFAの開裂のソリューションを収集する。使い捨て、PPピペットは切断カクテルのソリューションを転送すると便利です。 樹脂を洗浄し、残留ペプトイドを収集するために新鮮な切断カクテル1 mLを追加します。 2倍を繰り返します。 穏やかな窒素流を吹き付けることによってまたはバイオタージV10蒸発器を使用して、TFAを蒸発させる。 6 mLの内の原油を溶解HPLC用アセトニトリル/水の1:1（v / v）である。凍結し凍結乾燥。繰り返します。 粗生成物の重量を記録する。 -20 ° Cで乾燥粉末としてストアテストの開裂（オプション）：樹脂の0.5％のテスト切断をすばやく合成ペプトイドの純度と量を決定するために、正しい切断条件が選択されたかどうかを実行することができます。テストの開裂は、合成の進行状況を監視する場合に特に有効です。 3。 Polypeptoidの特性評価および精製分析用HPLC、エレクトロLC – MS、および/またはMALDI – TOFの組み合わせにより、粗生成物の純度を決定し、所望の分子量が存在しているかどうか。 溶解性のために、必要に応じて最小限のアセトニトリルと水の乾燥ペプトイド粉体の5〜10 mg / mLの溶液を調製します。埃や粒子を除去するために0.45μmのシリンジフィルターで粗ペプトイド製品のフィルタ透明な溶液。 分析HPLCとエレクトロスプレーLC – MSは：〜20μg/ mLの原油ペプトイドの溶液を調製します。フィルター孔径0.45μmのフィルターで200μL、20μLを注入する。 MALDI：ミックス1μLマトリックスと〜20 mg / mLのペプトイドの1μL。スポット1 MALDIプレート上でμLと風乾する。行列とアクイジションモードでは、サンプル（図5）に依存しています。 逆相分取HPLCで精製ペプトイド混合物を精製する。勾配とpolypeptoidの疎水性に基づいて列を（C4またはC18）を選択します。白色綿毛状の粉末で得られた画分、凍結、および凍結乾燥し、精製組み合わせる。最終製品の重量を記録する。 塩酸塩（オプション）の形成は：最小限のアセトニトリルと100 mMの塩酸（水溶液）で凍結乾燥した粉末を溶解する。あらかじめ秤量したガラスバイアルに移す。フリーズし、再凍結乾燥。 2倍を繰り返します。ペプトイド粉体の質量を決定するために重さを量り直す。 4。ペプトイドナノシートの形成このセクションではデ単鎖、配列特異的、両親媒性の36 merのペプトイド（図1）からシートを形成するためにプロトコルをcribes。ペプトイド鎖が合成された後、精製、および上記のように凍結乾燥し、得られた白色粉末は、2 mMのストック溶液を作るためにDMSOに溶解している。 1 DRAMのガラスバイアル内のシートの形成バッファー（10mMトリス- HCl、100mMのNaCl、水でpH8.0）に20μMペプトイド溶液500μLを準備します。最初に、ミックスにMilli – Q水、10倍のシート形成バッファー50μL、および渦の445μLを加える。その後、2mMのペプトイドストック溶液と優しくスワール溶液5μLを加える。ガラスバイアルにキャップを。 シートは、希薄水溶液ペプトイドソリューションの穏やかに撹拌することによって形成される。水平位置からシート内の立位の結果に徐々に傾斜ガラスバイアル。穏やかに振盪しながらも、シートが得られますが、シートが少ないストレートエッジを持つ小型となる傾向があります。シート形成のメカニズムのより徹底的な分析がreporteですD別々に2。 多くの高品質なシートでは、1〜3日間のために（<1 RPM）をゆっくりと水平軸の周りのガラスバイアルを回転させる。適切な技術的リソースRKVSD Rotamixチューブローテーターまたはカスタマイズされたロッカーは、継続的にこれを実行することができます。 ナノシートの透析（オプション）：特定のアプリケーションでは、それがいかなるフリーペプトイドチェーンまたはバッファ/塩を除去するために必要な場合があります。フロート- Lyzer 15分間、目的のバッファに100 kDのメンブレンを浸す。サンプルチャンバーに500μLペプトイドシートのソリューションを読み込みます。 60rpmで、磁気撹拌子で撹拌し、必要なバッファの500mlに浸す。シートの透析は4時間泳動する。毎時間、緩衝液の新鮮な株式と交換する。 5。ナノシートの蛍光顕微鏡ナノシートの蛍光画像は、ナイルレッド、その蛍光強度は、油圧でローカライズされたときに増加する環境に敏感な色素で撮像したophobic環境（図2）。 ナイルレッドの1μMの最終濃度を得るためにナノシート溶液100μLを100μMナイルレッドの1μLを追加。 お湯の1％アガロース溶液を作成し、プラスチックシャーレに注ぐ。アガロース溶液を厚さ約1 / 8インチであることを確認し、解決策は、平らな面に静かに冷却することができます。アガロースセットした後、スライドガラスを1cmの× 1 cmの正方形をカットして転送するヘラを使用してください。 アガロースの一部のシートソリューションのスポット1μL、同一平面上にシートを収集するには。アガロースは、表面にシートを残し、2分間バッファーを吸収することができます。画像は15分以内、それ以外のアガロースは脱水のために変形し始めます。 ソリューションの画像のシートに、スライドガラス上に20mmの直径0.12ミリメートルのガスケット内部に15μLをロードする。カバースリップでカバー。シートは、単に多くのシートWI、ガスケットなしでスライドガラスとカバーガラスの間に挟まれている場合LLのせん断と一見マイナーな蒸発は、シートが常に移動するようになります。 落射蛍光照明（アンドールiXonEMテキサスレッドフィルター付き+ EMCCDスペクトルを装着した例：オリンパスIX81倒立顕微鏡）下の画像シート。 6。ナノシートの走査型電子顕微鏡（SEM） シリコン基板（オプション）のプラズマエッチング：シリコンチップは、プラズマは、シートの吸着を助けるためにエッチングされる。プラズマクリーナー（例えばHarrickプラズマクリーナー/滅菌器PDC – 32G）の真空チャンバ内にシリコンチップを置きます。 200ミリトルにポンプダウンと18W（PDC – 32Gのための高設定）するためのRFコイルを設定します。 2分間エッチング。 プラズマ処理されたシリコン基板上にペプトイドシートの溶液20μLをドロップします。 3分間放置することができます。金ワイプの先端で余分な溶液を取り除く。ピペット表面上への水20μLとバッファと塩を除去するために再び過剰の溶液を取り除く。 4X繰り返します。 また、ダイヤルバッファと塩を除去する水に対してペプトイドシートのソリューションをyze。プラズマ処理したシリコン基板上に透析シートの溶液20μLをドロップします。空気は、サンプルを乾燥させる。 インレンズ検出器を持つとは1kVと5kVの（図3）との間のビームエネルギーでSEMによる画像のシート（例えばツァイスジェミニウルトラ- 55分析走査型電子顕微鏡）。 7。安全上の注意： ジメチルホルムアミド及びジクロロメタンを合理的に発癌性が疑われている。 N、N' -ジイソプロピルカルボジイミド、4 methylpiperdineとブロモ酢酸は皮膚、眼、および気道に有害です。彼らは注意してフードに使用する必要があります。皮膚から吸入または吸収された場合、それは有毒かもしれない、と露出を感作する可能性があります。空の容器も製品の残渣（液体/気体）を保持し、徹底的にボンネットからそれらを削除する前に洗い流してください。 TFAは強酸であり、上気道、眼に非常に破壊的である、と皮膚。 TFAは、呼吸器の損傷を避けるために、常にフードでTFAの濃縮された溶液を揮発性のキープもあります。 TFAのソリューションを処理する際に適切なPPE、そして、十分に注意してください。彼らはTFAと接触し、直ちに流出をクリーンアップする場合、速やかに手袋を変更します。 8。代表的な結果： このセクションでは、配列特異的な36 – merのペプトイド鎖の合成、特性評価、および精製を説明してその高度に秩序化されたナノシート3（図1）にフォールド。 ブロック電荷ペプトイドH – [NAE – NPE] 9 – [NCE – NPE] 9 – NH 2は Rinkアミド樹脂100mgのに合成した。 2 Mアミン溶液を残渣1-18および残留物19から36までの120分間、60分間実施された全ての置換反応、のために使用されていました。フェネチルアミンおよびBoc -エチレンジアミンが使用directl両方であったのに対し、t -ブチルβ-アラニン塩酸が遊離塩基（議論を参照）に変換されたY.樹脂を95％TFA、2.5％triispropylsilane、2時間2.5％の水で切断した。 TFAを留去し、得られた粘性油（〜180 mg）を6mlのアセトニトリルに再溶解：水1:1（V / V）。製品の純度（図4）と製品質量の存在は、分析用RP – HPLC（水勾配の30-80％アセトニトリル、両方が1 mL / minで30分間以上で0.1％（v / v）のTFAを含むから確認された60℃C18、5μm以下、50 X 2 mmのカラム）とMALDI（図5）とC。 Vydac C18カラム（10ミクロン、22ミリメートル× 250 mm）を逆相HPLCによる精製は、10 mL / minで60分以上0.1％TFAで水で30〜60％アセトニトリルのグラジエントを使用して、進んだ。列は各クロマトグラフィーの実行のための粗生成物60mgのがロードされました。精製した画分を分析用RP – HPLC（図4）から純度に基づいて結合し、白色綿毛状の粉末〜80 mgを得るために凍結乾燥した。 分子精製ブロック電荷ペプトイド重量は、MALDIによって確認された。アセトニトリルでペプトイドを精製した100μMの1μL：水1:1（v / v）を行列の1μL（アセトニトリルで5 mg / mLのα-シアノ-4 – ヒドロキシ桂皮酸と混合した：水1時01 V / Vと0.1％TFA）と1μLをMALDIプレートにスポットした。サンプル空気乾燥した後、それを応用バイオシステム/ MDS SCIEX 4800 MALDI TOF / TOFアナライザに置かれた。収集と処理モードは、直鎖状低質量でした。計算された重みは、自動的に遅延時間を調整するためにターゲットを絞った大量に入力されました。レーザー強度が3400に設定されていました。観測された質量、4981.2は、4981.74の計算質量に密接に一致する。 凍結乾燥精製した粉体を4℃で保存できる2 mMのストック溶液、℃にするためにDMSOに溶解しシートは、前述のプロトコルによって調製し、蛍光光学顕微鏡やSEM（図2および3）で撮像した。フィーチャーさ300μmまでの範囲のサイズが観測されている、とNOTABと様々な形状LY、ストレートエッジは顕著である。 図1ブロック電荷ペプトイドH – [NAE – NPE] 9のシーケンス- [NCE – NPE] 9 – NH 2。単鎖、ブロックの充電、両親媒性polypeptoid 36 – merの自己組み立ての高い順の、二次元ナノシート3に。計算された分子量が4981.74である。 図2。ペプトイドナノシートの蛍光顕微鏡像 。シートは、10mMトリス、100mMのNaCl、pH8.0の20μMペプトイドソリューションから形成された。シートは、1μMナイルレッドでアガロース上に結像された。スケールバーは100μmです。 図3。走査電子顕微鏡像ペプトイドナノシートの。シートは、10mMトリス、100mMのNaCl、pH8.0の20μMペプトイドソリューションから形成された。スケールバーは5μmです。 図4 H – [NAE – NPE] 9の分析用逆相HPLCトレース- [NCE – NPE] 9 – NH 2。原油と精製分析用HPLCトレース（少なくとも30-80％勾配60℃、30分以上を1 mL / minでC18、5μm以下、50 × 2 mmのカラムを持つC）原油のと精製されたブロック電荷ペプトイドH – [ NAE – NPE] 9 – [NCE – NPE] 9 – NH 2が表示されます。 図5 H – [NAE – NPE] 9のMALDI – TOF質量分析のトレース- [NCE – NPE] 9 – NH 2。観測された質量、4981.2は、計算された質量、4981.74に近い一致している。