מוצק שלב Submonomer סינתזה של פולימרים Peptoid שלהם ואת הרכבה עצמית לתוך מאוד מסודרים Nanosheets

1. Solid-Phase Submonomer סינתזה של Polypeptoids מוצק שלב הסינתזה (SPS) היא טכניקה נפוצה המשמשת לסנתז רצף ספציפי biopolymers צעד חכם, ישירות על תמיכה מוצק אינרטי כגון שרף פולימרי חרוז. התשואות צימוד גבוהה וקלות הסרת מגיב עודף הם היתרונות העיקריים של SPS. לאחר תגובת צימוד שרף, ריאגנטים עודף הם פשוט מרוקן את החרוזים נשטפים להיות מוכן לשלב את התגובה הבאה. לאחר התגובה סינתזה סופית, באורך מלא oligomers הם ביקע מ שרף לבין חומר פתרון שלב ניתן ללמוד עוד. כאן, אנו להתאים את ההליך SPS ליצור רצף ספציפי פולימרים peptoid. ההתקנה: כל השלבים של סינתזה peptoid ידנית יכול להתבצע פוליפרופילן, הפנויה (PP) מחסנית fritted או כוס fritted התגובה כלי מצוידים שסתום 3-בדרך. ביצוע כל הפעולות במנדף קטר. עבור incubations ב gכלי ילדה או מחסנית פלסטיק, לחבר יד אחת לספק חנקן לבעבע בעדינות את הפתרון הנכון עבור ערבוב. לחלופין, עבור incubations התגובה מחסנית חד פעמיות, חותם את שני הקצוות של מחסנית עם כובעים מקום שייקר רוטרי. כדי לנקז תערובות תגובה או שוטף, להתחבר אל הבית הריק באמצעות מלכודת בזבוז. הכלי צריך להיות fritted עם frit גס. Siliconize כלי זכוכית, כדי למנוע תגובה חרוזים יידבקו לקירות של כלי זכוכית. הכן פתרון של dichlorodimethylsilane 5% dichloroethane (v / v). מלאו כלי התגובה נקי ויבש בראש עם פתרון siliconizing, בואו לשבת במשך 30 דקות, אז לטמיון. שטפו את כלי פעם עם DCE ולאחר מכן פעם עם מתנול. הפתרון siliconizing ניתן לעשות שימוש חוזר, כך זה צריך להיות נשמר. אוויר או יבשה או להתנער מכל פתרון עודף לאפות את זכוכית עד יבש לאחר הסרת שסתום. תגובת כלי מגניב לפני הוספת שרף. הוספת 100 מ"ג (0.06 mmol) מחדש אמיד רינקחטא כלי התגובה fritted. יופי שרף על ידי הוספת 2 מ"ל של dimethylformamide (DMF). להתסיס ידי ניעור או מבעבע במשך 10 דקות. מסננים את הפתרון על ידי ואקום לבודד את שרף תפח. הוסף 1 מ"ל של 20% 4-methylpiperidine ב DMF (v / v) כדי deprotect הקבוצה Fmoc. להתסיס במשך 2 דקות ומסננים. חזור עם דגירה של 12 דקות. שוטפים את שרף על ידי הוספת 2 מ"ל של DMF, התססה למשך 15 שניות, וניקוז. חזור 3x. Bromoacetylation: הוסף 1 מ"ל של 0.6 M bromoacetic חומצה (0.6 mmol) ב DMF ו 86 μL של N, N'-diisopropylcarbodiimide (0.93 המקביל, 0.56 mmol). דגירה עם מבעבע עדין במשך 30 דקות, ואז לרוקן ולשטוף עם 2 מ"ל של DMF (לחזור 4x). תזוזה: הוסף 1 מ"ל של 1-2 מ אמין ב-N-methylpyrrolidinone. דגירה עם מבעבע עבור 30-120 דקות, ואז לרוקן ולשטוף עם DMF (מ"ל 4x 2). ממשיכים לגדול שרשרת peptoid על ידי חזרה על מעגל submonomer, צעדים 1.5 (bromoacetylation) ו 1.6 (displacement). לאחר עקירה הסופי נעשה, לשטוף עם 2 מ"ל של DMF (לחזור 4x), ואז 2 מ"ל של dichloromethane (לחזור 3x). שווי ולאחסן את כלי התגובה עד המחשוף. השהה בסינתזה (אופציונלי): כדי להשהות במהלך סינתזה peptoid, לסיים את התגובה עקירה והמשך לשלב 1.8. כדי להמשיך לגדול שרשרת peptoid, הפעל מחדש את הסינתזה של שרף מחדש נפיחות יבשים (שלב 1.2) ולחזור על מחזור submonomer (שלב 1.5 ו – 1.6). שרף יכול להיות יבשים מאוחסנים לאחר עקירה פרט העקירה 2 כי המצומד שרף peptoid עלול ליצור מוצר לוואי diketopiperazine מחזורית. עבור סינתזות סימולטני מרובים, מוצק שלב ואקום סעפת מיצוי מומלץ כדי למקסם את היעילות. סינתזה Peptoid יכול גם להיות אוטומטית על ידי כראוי תכנות שיטות סינתיסייזרים פפטיד זמינים מסחרית, כמו איפקס Aapptec 396, CEM סינתיסייזר ליברטי מיקרוגל טכנו חלבוןlogies בע"מ סינתיסייזר פרלוד. 2. המחשוף ואת Side-Chain Deprotection כל העברה של שרף מיובשים על בקבוקון זכוכית 20 מ"ל הנצנץ. עבודה בתוך ברדס ושימוש נאות ציוד מגן אישי, להוסיף 4 מ"ל של חומצה trifluoroacetic (TFA) קוקטייל מחשוף 1 (למשל 95% aq. TFA, ראה דיון) ל הנצנץ בקבוקון זכוכית המכסה בחוזקה. Shake במשך 10 דקות עד 2 שעות בטמפרטורת החדר (ראה דיון). איסוף הפתרון מחשוף TFA ידי סינון שרף באמצעות מחסנית, הפנויה fritted PP לתוך חדש, טרום שקל 20 מ"ל בבקבוקון scintillation זכוכית. הפנויה, PP פיפטה נוח להעביר את קוקטייל פתרונות מחשוף. הוסף 1 מ"ל של קוקטייל מחשוף טרי לשטוף את שרף ולאסוף כל peptoid שיורית. חזור 2x. להתאדות TFA ידי פיצוץ זרם עדין של חנקן או באמצעות V10 Biotage המאייד. Redissolve את הנפט הגולמי ב 6 מ"לשל אצטוניטריל / מים 01:01 (v / v) עבור HPLC. להקפיא lyophilize. חזור. רשום את המשקל של המוצר הגולמי. חנות כאבקה יבשה ב -20 ° C מחשוף מבחן (אופציונלי): מחשוף מבחן על 0.5% של שרף יכול להתבצע במהירות כדי לקבוע את המסה של טוהר peptoid מסונתז והאם התנאים המחשוף הנכון נבחרו. השסעים מבחן שימושיים במיוחד כדי לפקח על ההתקדמות של סינתזה. 3. אפיון טיהור Polypeptoid באמצעות שילוב של אנליטי HPLC, electrospray LC-MS, ו / או MALDI-TOF, לקבוע את טוהר של המוצר הגולמי והאם משקל מולקולרי הרצוי הוא ההווה. הכן ~ פתרון 5-10 מ"ג / מ"ל ​​של אבקת peptoid יבש במים עם אצטוניטריל מינימלי כנדרש על מסיסות. הפתרון ברור סינון של המוצר peptoid גולמי עם מסנן 0.45 מיקרומטר מזרק כדי להסיר אבק וחלקיקים. אנליטית HPLC ו electrospray LC-MS: הכן ~ 20 מיקרוגרם / מ"ל פתרון peptoid גולמי. סינון 200 μL עם מיקרומטר 0.45 מסנן ולהזריק 20 μL. MALDI: מערבבים 1 μL של peptoid ~ מ"ג / מ"ל 20 עם מטריקס 1 μL. 1 Spot μL בצלחת MALDI ולאפשר לאוויר יבש. מטריקס מצב הרכישה תלויה מדגם (איור 5). לטהר את תערובת peptoid גולמי עם הפוכה שלב הכנה HPLC. בחר את שיפוע ועמודה (C4 או C18) מבוסס על hydrophobicity של polypeptoid. שלב מטוהרים שברים, להקפיא ו lyophilize, וכתוצאה מכך אבקה לבנה ורכה. רשום את המשקל של המוצר הסופי. כינונה של HCl מלח (אופציונלי): Redissolve את אבקת lyophilized ב 100 מ"מ HCl (aq.) עם אצטוניטריל מינימלית. מעבירים הבקבוקון טרום שקל זכוכית. להקפיא מחדש lyophilize. חזור 2x. Reweigh כדי לקבוע מסה של אבקת peptoid. 4. Nanosheet Peptoid גיבוש סעיף זה describes את הפרוטוקול כדי ליצור גיליונות משרשרת אחת, רצף ספציפי, amphiphilic 36-mer peptoid (איור 1). לאחר peptoid גדיל מסונתז, מטוהרים, ו lyophilized כמתואר לעיל, האבקה הלבנה והתוצאה היא מומס DMSO לעשות 2 מניות פתרון מ"מ. הכן 500 μL של פתרון peptoid 20 מיקרומטר במאגר היווצרות גיליון (10 mM טריס-HCl, 100 mM NaCl, pH 8.0 במים) בתוך צנצנת זכוכית 1 DRAM. ראשית, להוסיף 445 μL של מילי-Q מים, 50 μL של היווצרות חיץ גיליון 10x, ו – וורטקס לערבב. לאחר מכן, להוסיף 5 μL של 2 פתרון peptoid mM מניות בעדינות פתרון מערבולת. שווי בקבוקון זכוכית. פחים נוצרות על ידי תסיסה העדין של פתרון peptoid לדלל את מימית. הטיית לאט לאט בקבוקון זכוכית מעמדת האופקי לתוצאות תנוחה זקופה בסדינים. עדין רועדת גם התשואות גיליונות, אולם הסדינים נוטים להיות קטנים יותר עם קצוות ישרים פחות. ניתוח מעמיק יותר של מנגנון היווצרות גיליון reporteד בנפרד. 2 עבור באיכות גבוהה גיליונות רבים, לסובב את בקבוקוני זכוכית על הציר האופקי לאט (<1 RPM) עבור 1-3 ימים. משאבים טכניים מתאימים RKVSD rotator Rotamix צינור או נדנדה אישית יכול לבצע את זה ללא הרף. דיאליזה של Nanosheets (אופציונלי): ביישומים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך להסיר את כל רשתות peptoid חינם או מאגרים / מלחים. משרים Float-A-100 Lyzer קרום KD במאגר הרצוי במשך 15 דקות. טען פתרון μL גיליון 500 peptoid החדרה המדגם. משרים 500 מ"ל של המאגר הרצוי, תוך ערבוב עם בר ומערבבים מגנטי בסל"ד 60. אפשר דיאליזה של גיליונות להמשיך במשך 4 שעות. כל שעה להחליף עם מלאי חדש של פתרון חיץ. 5. מיקרוסקופ פלואורסצנטי של Nanosheets תמונות של הקרינה nanosheets היו צילמו עם הנילוס האדום, צבע רגיש לסביבה, אשר מגביר את עוצמת הקרינה כאשר הוא מקומי hydrסביבות ophobic (איור 2). הוסף 1 μL של 100 מיקרומטר הנילוס האדום μL 100 הפתרון nanosheet לקבל ריכוז סופי של 1 מיקרומטר של הנילוס האדום. הפוך את פתרון 1% agarose במים חמים ויוצקים לתוך צלחת פטרי פלסטיק. ודא הפתרון agarose הוא כ 1 / 8 אינץ עבה ולאפשר פתרון להתקרר ללא הפרעה על משטח שטוח. לאחר מגדיר agarose, השתמש מרית לחתוך ולהעביר 1 ס"מ x 1 ס"מ ריבועים לשקופית זכוכית. כדי לאסוף את הסדינים במישור אותה נקודה, 1 μL של פתרון סדין על פיסת agarose. אפשר agarose לספוג את המאגר במשך 2 דקות, והשאיר את הסדינים על פני השטח. תמונה בתוך 15 דקות, אחרת agarose יתחיל לעוות עקב התייבשות. כדי גיליונות התמונה פתרון, עומס 15 μL בתוך אטם 20 מ"מ בקוטר 0.12 מ"מ על זכוכית שקופית. מכסים coverslip. אם הסדינים הם פשוט דחוקה ללא אטם בין שקופית זכוכית coverslip, סדינים רבים wiגזירה ll ואת אידוי מינורי לכאורה יגרום הסדינים הזמן לזוז. תמונה יריעות תחת תאורה epifluorescence (למשל מיקרוסקופ IX81 אולימפוס הפוך מצויד iXonEM אנדור + ספקטרום EMCCD עם מסנן אדום טקסס). 6. מיקרוסקופית אלקטרונים סורק (SEM) של Nanosheets פלזמה לחרוט על פני המצע סיליקון (לא חובה): שבבי סיליקון חקוקות פלזמה לסייע ספיחה של גיליונות. מניחים את שבבי סיליקון בתא ואקום של שואב פלזמה (למשל Harrick פלזמה מנקה / מעקר PDC-32G). משאבה אל mTorr 200 ולהגדיר את סליל RF ל 18W (הגדרה גבוהה עבור PDC-32G). Etch במשך 2 דקות. צניחה של 20 μL פתרון גיליון peptoid על מצע פלזמה שטופלו סיליקון. אפשר לשבת במשך 3 דקות. הסרת עודפי עם פתרון קצה קים-לנגב. פיפטה 20 μL של מים על פני השטח ולהסיר פתרון עודף שוב להסיר את החיץ ומלחים. חזור על 4x. לחילופין, לחייגyze הפתרונות גיליון peptoid נגד מים כדי להסיר את החיץ ומלח. צניחה של 20 μL פתרון גיליון dialyzed על הפלזמה שטופלו מצעי סיליקון. האוויר יבש המדגם. תמונה הסדינים עם SEM (למשל Zeiss ג'מיני Ultra-55 מיקרוסקופ אלקטרונים סורק אנליטית) עם גלאי בתוך העדשה ו באנרגיות הקורה בין kV 1 ו – 5 kV (איור 3). 7. בטיחות הערות: Dimethylformamide ו Dichloromethane חשודים כמסרטנים באופן סביר. N, N'-Diisopropylcarbodiimide, 4-methylpiperdine וחומצה bromoacetic הם מסוכנים על העור, העיניים ודרכי הנשימה. הם צריכים לשמש מכסה המנוע בזהירות. זה יכול להיות רעיל אם נשאף או נספגים דרך העור, חשיפה עלולה לגרום לרגישות. מכולות ריקות לשמור שאריות של המוצר (נוזל / אדי) ולכן יש לשטוף ביסודיות לפני הוצאתם למכסה המנוע. TFA היא חומצה חזקה, היא הרסנית מאוד בדרכי הנשימה, העיניים העליונות,העור. TFA היא גם נדיפים, לשמור תמיסות מרוכזות של TFA בשכונה בכל עת כדי למנוע נזק הנשימה. השתמש PPE ראויה, זהירות בעת הטיפול פתרונות של TFA. כפפות שנה מיד אם הם באים במגע עם TFA, ומיד לנקות את כל נשפך. 8. נציג תוצאות: סעיף זה מתאר את הסינתזה, אפיון, וטיהור של רצף ספציפי שרשרת peptoid 36-mer כי קפלי לתוך nanosheet הורה מאוד 3 (איור 1). הבלוק תשלום peptoid H-[נאייה-NPE] 9 – [Nce-NPE] 9-NH 2 היה מסונתז על 100 מ"ג של שרף אמיד רינק. פתרון 2 M אמין שימש כל התגובות עקירה, אשר בוצעו במשך 60 דקות שאריות 1-18 ו – 120 דקות שאריות 19-36. t-Butyl בטא אלנין HCl הוסב לבסיס חופשי (ראה דיון) ואילו phenethylamine ו-BOC ethylenediamine היו שניהם השתמשו directlי ' שרף היה ביקע TFA עם 95%, triispropylsilane 2.5%, 2.5% מים למשך 2 שעות. TFA היה התאדו ושמן צמיג וכתוצאה מכך (~ 180 מ"ג) מחדש מומס אצטוניטריל 6 מ"ל: מים 01:01 (v / v). טוהר המוצר (איור 4) ונוכחות של מסת מוצר אושרה על ידי מ אנליטית RP-HPLC (30-80 אצטוניטריל% ב צבע מים, הן המכיל 0.1% (v / v) TFA, ב 1 מ"ל / דקה מעל 30 דקות ב 60 ° C עם C18, 5 מיקרומטר, 50 X 2 טור מ"מ) MALDI (איור 5). טיהור עם פאזה הפוכה HPLC על עמודה C18 Vydac (10 מיקרומטר, 22 מ"מ x 250 מ"מ) המשיך, באמצעות שיפוע של אצטוניטריל 30-60% במים עם TFA 0.1% מעל 60 דקות בכל 10 mL / min. הטור היה עמוס 60 מ"ג של המוצר הגולמי לריצה כל chromatographic. שברים מטוהרים אוחדו מבוסס על טוהר מ אנליטית RP-HPLC (איור 4) ו lyophilized להניב ~ 80 מ"ג של אבקה לבנה ורכה. מטוהרים לחסום תשלום מולקולרית peptoidמשקל אושרה על ידי MALDI. 1 μL של 100 מיקרומטר מטוהרים peptoid ב אצטוניטריל: מים 01:01 (v / v) עורבב עם μL 1 של מטריצה ​​(5 מ"ג / מ"ל ​​α-cyano-4-hydroxycinnamic חומצה אצטוניטריל: מים 01:01 v / v ו 0.1% TFA) ו 1 μL זוהה על הצלחת MALDI. אחרי המדגם אוויר יבש, הוא הוצב מנתח יישומית Biosystem / MDS SCIEX 4800 TOF / TOF MALDI. מצבי רכישת ועיבוד היו מסה נמוכה ליניארי. המשקל מחושב נקלטה המסה ממוקד להתאים באופן אוטומטי למשך זמן העיכוב. עוצמת הלייזר נקבע 3400. המסה ציין, 4981.2, גפרורים הדוק המסה מחושב של 4,981.74. האבקה מטוהרים lyophilized פורקה ב DMSO לעשות 2 מניות mM פתרון, אשר ניתן לאחסן 4 ° C. פחים הוכנו על ידי פרוטוקול הנ"ל צילמו עם מיקרוסקופיה אופטית פלואורסצנציה ו SEM (איור 2 ו -3). במגוון צורות וגדלים עם תכונה הנעים עד 300 מיקרומטר הם נצפו, ו notably, ישר קצוות בולטים. איור 1 רצף של גוש תשלום peptoid H-[נאייה-NPE] 9 -. [Nce-NPE] 9-NH 2. שרשרת אחת, תשלום לחסום, polypeptoid amphiphilic 36-mer עצמית מרכיב לתוך מאוד מסודרים, דו מימדי nanosheets 3. חישוב משקל מולקולרי הוא 4981.74. באיור 2. תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של nanosheets peptoid. פחים נוצרו מפתרון peptoid 20 מיקרומטר 10 mM טריס, 100 מ"מ NaCl, pH 8.0. הסדינים היו הדמיה על agarose עם 1μM הנילוס האדום. ברים הם סולם 100 מיקרומטר. באיור 3. סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים תמונותשל nanosheets peptoid. פחים נוצרו מפתרון peptoid 20 מיקרומטר 10 mM טריס, 100 מ"מ NaCl, pH 8.0. ברים הם סולם 5 מיקרומטר. איור 4 שלב אנליטית HPLC הפוכה זכר H-[נאייה-NPE] 9 -. [Nce-NPE] 9-NH 2. גולמי מטוהרים אנליטית HPLC עקבות (30-80% שיפוע של 1 מ"ל / דקה במשך 30 דקות ב 60 ° C עם C18, 5 מיקרומטר, 50 x 2 טור מ"מ) של נפט גולמי ו מטוהרים לחסום תשלום peptoid H-[ נאייה-NPE] 9 – [Nce-NPE] 9-NH 2 מוצג. איור 5 MALDI-TOF המוני ספקטרוסקופיה זכר H-[נאייה-NPE] 9 -. [Nce-NPE] 9-NH 2. המסה ציין, 4981.2, הוא הסכם קרוב המסה מחושב, 4981.74.