الصلبة مرحلة تجميع Submonomer من البوليمرات Peptoid واحترامهن الجمعية ، في الارتحال التي تأمر Nanosheets
Summary
ويرد بسيطة وعامة التوليف peptoid الطريقة اليدوية التي تنطوي على المعدات والكواشف الأساسية المتاحة تجاريا ، مما يمكن توليفها peptoids بسهولة في معظم المختبرات. يوصف التوليف ، وتنقية وتوصيف ل36mer peptoid amphiphilic ، وكذلك التجميع الذاتي حيز العالية أمر nanosheets.
Abstract
Peptoids هي فئة جديدة من بيوميمتيك ، غير الطبيعية تسلسل الخاصة التي تقاوم التحلل البروتيني heteropolymers ، المعرض نشاط بيولوجي محتمل ، وأضعاف النانو في أعلى الترتيب. يشبه في بنيته الببتيدات ، وبولي peptoids N – استبداله glycines ، حيث تعلق على الجانب سلاسل النيتروجين بدلا من الكربون ألفا. تخفيف بهم من التوليف والتنوع الهيكلي يسمح اختبار مبادئ التصميم الأساسية لمحرك دي نوفو تصميم وهندسة المواد الجديدة النشطة بيولوجيا وذات البنية النانومترية.
هنا ، هو تقديم دليل بسيط peptoid بروتوكول التوليف التي تسمح للتوليف polypeptoids سلسلة طويلة (تصل إلى 50mers) في غلة ممتازة. مطلوبة المعدات الأساسية فقط ، وتقنيات بسيطة (مثل نقل السائل ، والترشيح) ، والكواشف المتاحة تجاريا ، مما يجعل peptoids إضافة إلى مجموعة أدوات للوصول العديد من الباحثين. ويزرع في العمود الفقري peptoid one مونومر في وقت تIA submonomer الأسلوب الذي يتكون من مرحلتين مونومر دورة بالإضافة إلى ذلك : أسيلة والتشريد. أولا ، وحامض bromoacetic تفعيلها في الموقع مع N ، N' – diisopropylcarbodiimide acylates راتنج متجهة الأمينات الثانوية. الثانية ، والتشريد محب النواة من بروميد من الأمينات الأولية التالي لتقديم سلسلة من الجانبين. وكرر دورة على مرحلتين حتى يتم الوصول إلى طول السلسلة المطلوب. كفاءة اقتران هذه الدورة على مرحلتين يتجاوز عادة 98 ٪ ويمكن تجميع peptoids طالما 50 البقايا. سلاسل متنوعة الانضباطي للغاية ودقيقة وقابلة للتحقيق كيميائيا مع أسلوب submonomer كما يمكن أن المئات من الأمينات الأولية متوفرة بسهولة إدراجها مباشرة.
Peptoids آخذة في الظهور كمادة بيوميمتيك تنوعا للبحوث nanobioscience لما لها من قوة الاصطناعية ، والمرونة ، ويأمر على المستوى الذري. للطي من سلسلة واحدة ، انفورما ، amphiphilicوقد تجلى مؤخرا نشوئها الغنية polypeptoid الى nanosheet العالية المطلوبة. هذا هو peptoid 36 مير التي تتكون من المونومرات ثلاثة فقط متاحة تجاريا : مسعور ، وأنيوني الموجبة. ودفن مسعور سلاسل الجانب الفنيل في حين أن جوهر nanosheet أمين الأيونية وسلاسل محاذاة الجانب الكربوكسيل على وجوه ماء. وnanosheets peptoid بمثابة منصة المحتملة لmimetics الغشاء ، mimetics البروتين ، وتصنيع الجهاز ، وأجهزة الاستشعار. ووصف الطرق لتخليق peptoid ، وتشكيل ورقة ، والتصوير المجهري وتوفر طريقة بسيطة لتمكين التصاميم nanosheet peptoid المستقبل.
Protocol
Discussion
وأهمية التطبيقات
يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة وفعالة لتجميع وpeptoid مائي التجميع الذاتي للpeptoids في nanosheets. معظم المختبرات قادرة بسهولة من تجميع peptoids لأن المواد الرخيصة ، والخبرات والتقنيات الأساسية واضحة وتستخدم 4. وبالمثل ، فإن التجميع الذاتي للرقيقة جدا nanosheets العالية أمر يتطلب مجرد تكرار إمالة قارورة حل peptoid مائي مخفف 2. Peptoids هي مادة واعدة للبحوث الطبية البيولوجية وعلم النانو لأنها قوية ومرنة صناعيا بعد تسلسل محدد والانضباطي للغاية 5. وقد أثبتت Peptoids النشاط البيولوجي (6،7 المداواة ، والتشخيص 8 ، والتسليم بين الخلايا 9-10) وقابلة للطي في النانو الهرمية 3 ، 11-14. بسبب التركيب على وحدات ، واندماجي peptoid librويمكن تصنيعه بسهولة 15-19 الحمل وفرزهم لسلسلة واسعة من الأنشطة أو الممتلكات. على وجه الخصوص ، nanosheets بمثابة منصة المحتملة لعرض السقالات ثنائي الأبعاد ، mimetics الغشاء ، وأجهزة الاستشعار البيولوجية ، وتصنيع البروتين mimetics الجهاز. مع تسلسل مختلف ممكن عمليا لا ينضب ، عالم الأبحاث peptoid تتوسع بسرعة.
المتغيرات في التوليف submonomer الصلبة مرحلة polypeptoids
لأن القدرة على اختيار من لا يصدق أبجدية كبيرة ومتنوعة من مونومرات 20 ، الأسلوب submonomer يحتاج تعديلات في بعض الأحيان عن الحالات التي تكون فيها زيادة كفاءة اقتران كل خطوة من شأنها تحسين العائد الناتج الكلي. ادراج محمية سلاسل الجانب متجانسة يتطلب استخدام حمض الكلوروأسيتيك بدلا من حمض bromoacetic 21. تمديد أوقات التشرد والتعليم العاليوتستخدم عادة تركيزات الأمينات بعد حوالي 20 جوانات لمتواليات peptoid طويلة أو الأمينات أقل أليف النواة. تسخين وعاء التفاعل إلى 35 درجة مئوية ، وذلك باستخدام سفينة رد فعل المياه تغلف ، ويساعد على دفع التفاعل. لدرجة عالية من الأمينات المتقلبة مثل isopropylamine ، لا بد من توخي الحذر لتجنب التبخر.
الأمينات في شكل ملح حمض الهيدروكلوريك ، مثل حمض الهيدروكلوريك بيتا ألانين تي بوتيل ، والحاجة ليكون حرا مقرها قبل أن يتم عرضه في رد فعل التشرد. ويمكن تحقيق هذا عن طريق إذابة أو تعليق أمين في DCM (~ 5G amine/25 مل DCM) ، وتحييد بمحلول متساوي المولية من هيدروكسيد الصوديوم المائي في قمع separatory. ويتم جمع طبقة DCM ويغسل طبقة مائية مع DCM إضافية. تجفف طبقات DCM مجتمعة أكثر من كبريتات الصوديوم وتصفيتها في أسفل القارورة الجولة ما قبل وزنه. إزالة المذيب عن طريق التبخر دوارة لتسفر عن النفط ، وتسجيل وزن المنتج.
الزيتوز الخطوة الانقسام ، TFA كوكتيل الانقسام والانقسام الوقت يعتمد على عدد ومتنوعة لحماية الفئات المستخدمة. المبادئ التوجيهية للكوكتيلات تشطر تتشابه الانقسامات التقليدية deprotection الببتيد 1. عموما ، هناك حاجة الدقيقة 10 حضانات لمتواليات من دون حماية أو الجماعات أو متواليات مع عدد قليل من الجماعات عطوب حمض حماية عالية (مثل BOC ، trityl). وأوصى اثنين من حضانات ساعة لمتواليات أكثر صعوبة مع جماعات حماية (على سبيل المثال تي بوتيل استر ، MTR ، PBF) أو متواليات مع العديد من الجماعات لضمان حماية كاملة من كل deprotection السلسلة. والمنتجات الخام peptoid حل عموما في أسيتونتريل : 1:1 المياه (V / V) ، ولكن بنسب أعلى أسيتونتريل هي مشتركة مع سلاسل جنب مع hydrophobicity شامل عالية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر لي بيونغ تشول ، تشوي هو صموئيل وفيليب لمساعدة قيمة. ونفذ هذا العمل في مسبك الجزيئية في مختبر لورانس بيركلي الوطني ، وهو مدعوم من قبل مكتب المفوضية ، والعلوم العلوم الأساسية للطاقة ، من وزارة الطاقة الأميركية بموجب العقد رقم DE – AC02 – 05CH11231 وزير الدفاع للحد من التهديد الوكالة تحت رقم العقد : IACRO – B0845281.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Dimethylformamide | EMD | EM-DX1726P-1 | 99+% |
| N-methylpyrrolidinone | BDH | BDH1141-4LP | 99% |
| Bromoacetic Acid | Acros Organics | 200000-106 | 99% |
| 4-Methylpiperidine | Sigma Aldrich | M73206 | 96% |
| N,N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex | 001100 | 99.5% |
| Dichloromethane | EMD | EMD-DX0835 | ACS grade |
| Acetonitrile | EMD | EM-AX0145P-1 | 99.8% |
| Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | T6508 | 99% |
| Triisopropylsilane | Sigma Aldrich | 233781-10G | For TFA cleavage |
| 1,2-Dichloroethane | JT Baker | JTH076-33 | For siliconization of glass reaction vessels |
| Phenethylamine | Sigma Aldrich | 407267-100ML | >99.5% Hydrophobic side-chain amine |
| Boc-ethylenediamine | CNH Technologies | C-1112 | Cationic side-chain amine |
| t-Butyl beta-alanine HCl | Chem-Impex International | 04407 | Anionic side-chain amine |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | C8982-10X10MG | For MALDI matrix |
| Nile Red | Sigma Aldrich | 19123-10MG | For fluorescence Imaging |
| Dichlorodimethylsilane | Sigma Aldrich | 80430-500G-F | For siliconization of glass reaction vessels |
| Disposable PP fritted cartridge | Applied Separations | 2416 | 6 mL polypropylene cartridge with 20 mm PE frit |
| Disposable 3 way luer adapter | Cole Parmer | 31200-80 | Stopcock for disposable manual synthesis reaction vessel |
| Luer Lock ring | Cole Parmer | 45503-19 | ¼” fitting for disposable manual synthesis reaction vessel |
| Fittings Luer | Cole Parmer | 45500-20 | ¼” fitting for disposable manual synthesis reaction vessel |
| Disposable PP pipets | VWR | 16001-194 | For TFA transfers |
| Luer lock plastic syringe | National Scientific | S7515-5 | 6 mL syringes |
| 1 dram glass vial | VWR | 66011-041 | With phenolic molded screw cap with polyvinyl-faced pulp liner |
| 20 mL scintillation vial | VWR | 66022-060 | With attached PP cap and pulp foil liner |
| Secure-Seal adhesive spacer | Invitrogen | S-24736 | For fluorescence imaging |
| Glass slides | Electron Microscopy Sciences | 63411 | For fluorescence imaging |
| Cover slip | VWR | 48366-067 | For fluorescence imaging |
| 4” Silicon wafer | Ted Pella | 16007 | Pre-dice in 5×7 mm chips |
| 0.45 filter | VWR, Acrodisc | 28143-924 | For HPLC. PTFE membrane |
| Agarose | BD | 212272 | For fluorescence imaging |
| SPE Vacuum Manifold | Sigma Aldrich | 57044 | Example of SPE vacuum manifold |
| Fritted glass vessel | Ace glass | 6402-12 | Porosity C frit |
| Plasma Cleaner/Sterilizer | Harrick Plasma | PDC-32G | Example of plasma cleaner to prepare silicon chips for SEM |
References
- King, D. S., Fields, C. G., Fields, G. B. A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis. Int. J. Pept. Pro. Res. 36, 255-266 (1990).
- Sanii, B., Kudirka, R., Cho, A., Venkateswaran, N., Oliver, G. K., Olson, A. M., Tran, H., Harada, R. M., Tan, L., Zuckermann, R. N. Shaken, not stirred: Collapsing a peptoid monolayer to produce free-floating, stable nanosheets. J. Am. Chem. Soc. , (2011).
- Kudirka, R., Tran, H., Sanii, B., Nam, K. T., Choi, P. H., Venkateswaran, N., Chen, R., Whitelam, S., Zuckermann, R. N. Folding of a single-chain, information-rich polypeptoid sequence into a highly-ordered nanosheet. Bioploymers: Peptide Science. 96, 586-595 (2011).
- Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Zuckermann, R., Pohl, N., Kirshenbaum, K. Rapid multistep synthesis of a bioactive peptidomimetic oligomer for the undergraduate laboratory. J. Chem. Ed. 87, 637-639 (2010).
- Fowler, S. A., Blackwell, H. E. Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function. Org. Biomol. Chem. 7, 1508-1524 (2009).
- Zuckermann, R. N., Kodadek, T. Peptoids as potential therapeutics. Curr. Op. Mol. Ther. 11, 299-307 (2009).
- Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. Peptoids that mimic the structure, function and mechanism of helical antimicrobial peptides. , 105-2794 (2008).
- Yam, A. Y., Wang, X., Gao, C., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Bleua, T., Halla, J., Fedynyshyn, J., Allauzen, S., Peretz, D., Salisbury, C. M. A Universal method for detection of amyloidogenic misfolded proteins. Biochem. 50, 4322-4329 (2011).
- Huang, C. -. Y., Uno, T., Murphy, J. E., Lee, S., Hamer, J. D., Escobedo, J. A., Cohen, F. E., Radhakrishnan, R., Dwarki, V., Zuckermann, R. N. Lipitoids – novel cationic lipids for cellular delivery of plasmid DNA in vitro. Chem. Biol. 5, 345-354 (1998).
- Schroeder, T., Niemeier, N., Afonin, S., Ulrich, A. S., Krug, H. F., Bräse, S. Peptoidic amino- and guanidinium-carrier systems: Targeted drug delivery into the cell cytosol or the nucleus. J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).
- Murnen, H. K., Rosales, A. M., Jaworski, J. N., Segalman, R. A., Zuckermann, R. N. Hierarchical self-assembly of a biomimetic diblock copolypeptoid into homochiral super helices. J. Am. Chem. Soc. 132, 16112-16119 (2010).
- Nam, K. T., Shelby, S. A., Marciel, A. B., Choi, P. H., Chen, R., Tan, L., Chu, T. K. Free-floating ultra-thin two-dimensional crystals from sequence-specific peptoid polymers. Nature. Mater. 9, 454-460 (2010).
- Burkoth, T. S., Beausoleil, E., Kaur, S., Tang, D., Cohen, F. E., Zuckermann, R. N. Toward the synthesis of artificial proteins: The Discovery of an amphiphilic helical peptoid assembly. Chemistry & Biology. 9, 647-654 (2002).
- Murphy, J. E., Uno, T., Hamer, J. D., Cohen, F. E., Dwarki, V., Zuckermann, R. N. A Combinatorial approach to the discovery of efficient cationic peptoid reagents for gene delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 1517-1522 (1998).
- Mora, P. u. i. g., Masip, I. s. a. b. e. l., Cortés, N. u. r. i. a., Marquina, R. e. g. i. n. a., Merino, R. a. m. &. #. 2. 4. 3. ;. n., Merino, J. e. s. &. #. 2. 5. 0. ;. s., Carbonell, T. e. r. e. s. a., Mingarro, I. s. m. a. e. l., Messeguer, A. n. g. e. l., Pérez-Payá, E. n. r. i. q. u. e. Identification from a positional scanning peptoid library of in vivo active compounds that neutralize bacterial endotoxins. J. Med. Chem. 48, 1265-1268 (2005).
- Zuckermann, R. N. Discovery of nanomolar ligands for 7-transmembrane G-protein coupled receptors from a diverse (N-substituted)glycine peptoid Library. J. Med. Chem. 37, 2678-2685 (1994).
- Alluri, P., Liu, B., Yu, P., Xiao, X., Kodadek, T. Isolation and characterization of coactivator-binding peptoids from a combinatorial library. Moleular Biosystems. 2, 568-579 (2006).
- Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-(substituted)glycine peptoid libraries. Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).
- Culf, A. S., Ouellette, R. J. Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (α peptoids) and derivatives. Molecules. 15, 5282-5335 (2010).
- Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis. J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).
