PTSDの、ニューラル血液学的および行動的相関関係を明らかにするための動物モデルにおけるバイオマーカー

1。 PTSDの動物行動モデル被験者：男性アルビノのSprague Dawleyラット（タコニック農場、Derwood、メリーランド州）に使用され、ストレスプロトコルの投与時に200グラムの重み150。 食品、水の摂取量と体重増加の測定：100の重量を量る実験用ラットに到着±25グラムでケージ（：45x24x20センチメートルケージサイズ）に2が収容されています。ケージパディング基板（木くず）を週2回に変更されます。温度（22±4℃） – および相対湿度（30から70パーセント）が制御されている環境一週間反転12時間の光周期（0600から1800：1800/0600とオフのライト）に維持されている動物実験前。水と、標準のペレット化チャウ（ハーラン（2018）18％タンパク質デントダイエット、グローバルダイエット、ハーランTeklad）ホームケージ内で自由に利用可能であり、bodyweightsは3日前に毎日記録され、3日間と3日間ストレスの停止後。 順応：ラットをBO〜3日間順応する動物施設及び音響驚愕室番目。音響驚愕室にそれらを順応させ、動物を最初の測定の前に3日間連続で毎日5分間それで処理されます。 プロトコルを強調した：動物が平等に自分の体重と基準驚愕反応に基づいて、各グループに割り当てられています。テストは、動物の二つのグループで行われ、各グループは、16匹の動物からなる。グループ1は、ストレスプロトコルを受信して​​、グループ2はコントロールです。 ストレス曝露プロトコルは3日連続で一日一回繰り返される連続的な各セッションは拘束から成り、2時間の手順（ "避けられない"）とテールショックです。ストレスは、（0800と1200のウィンドウ内）午前中に行われます。動物は換気プレキシガラスチューブに固定化されることによって抑制される。四電気ショック（2ミリアンペア、3秒持続、動物試験ケージグリッド床ショッカー、Coulbournインスツルメンツ、米国）150トンのセミランダムな間隔でしっぽに配信されますO 210秒（グラフィックステート楽譜作成ソフトウェア、Habitestユニバーサルリンク、Co​​ulbournインスツルメンツ、米国）。 2ミリアンペアでの刺激は、刺激出力は実験者の指の間に配置されたとき、それが嫌悪であるため、選択したが、痛みを伴うされませんでした。電極ゲルは、電極及びラットの尾の皮膚との間にゲルを行うの薄層を形成するために、綿棒を使用して適用されます。電極クリップは尾の血液循環に影響を与えることなく、良好な接続を確保するために尻尾に調整し、接続されています。 音響驚愕反応（ASR）：音響驚愕反応測定は驚愕反応·アコースティック·テスト·システム（Coulbournインスツルメンツ、コロンバス、オハイオ州、米国）3を用いて行った。このシステムは、防音室での重量に敏感なプラットフォームで構成されています。驚愕の各プラットフォームでは、ひずみゲージですトランスデューサは、使用前にキャリブレーションが必要です。まず、カプラーは、キャリブレーションのためのDC結合モードである必要があります。このモードでは、カプラの出力ディrectlyプラットフォームから入力、スタティック重みを持つキャリブレーションに必要なモードは次のとおりです。驚愕反応を示している力で、その唯一の急激な変化が、出力されますので、変換器は、実験中にAC結合モードに切り替えられます。音刺激に応答して動物の動きは、このように、各プラットフォームの内部ひずみゲージによる電圧変化として測定され、驚愕-誘発刺激の発症の200 ms以内に生じる最大応答として記録されます。 単独で100デシベル、プレパルス、110デシベルだけでも、プレパルスで110デシベル、プレパルス単独無刺激コントロールと100デシベル：刺激試験の6種類があります。各試験の種類は、8回提示された。試験の種類は、次の効果と馴化を避けるために、ランダムな順序で表示されます。試行間間隔は15〜25秒までの範囲からランダム。 8件の試験のうち最大値のみが結果に収集され、最終的に同じ日の動物の体重で調整。動物は1日bをテストされていますストレス·プロシージャまたはその他の治療の連続した​​3日間の最終日に続くベースラインの読みと1日、7日、14日、21日などEFOREストレスや他の治療。 データ解析： ASR：ベースラインの％=（絶対振幅/ベースラインの絶対振幅）×100％：音響驚愕反応の振幅がなるたびに、式を用いて算出されている、 "ベースラインの％"として表現さ​​れテストされています。各試験日については、反復測定のためANOVAsは、SPSS（バージョン16）のソフトウェアを使用して、ストレス状態や薬物投与量の要因と驚愕振幅で実行されます。テューキー、ボンフェローニ、またはダネットのテストは、個々のグループの間に有意な事後の差を評価するために使用されます。データは平均値±SEMとして表され成長：体重および摂餌と水の消費量は、ストレスプロトコルの次の完成は14日、21日と30日-1前のストレスにと日に測定されています。統計分析：食品および水の摂取データは1に供される分散の方法反復測定分析（ANOVA）。時間をかけて食糧消費率の変化を分析するために、食物摂取量をさらにストレスプロトコルおよびグループ間の体重の初期差異によって誘発される体重のばらつきを最小限に抑えるために、被験者の体重で割っています。すべての手順は、インスティテューショナルアニマルケア使用委員会（IACUC）に従って承認の下で行われています。 2。脳の解剖楽器＆材料： 麻酔瓶：これは、このような "薬剤師ジャー"、 "コッ​​トンボールジャー"、または、直径約6インチの高さと5インチを測定する蓋付きのガラスの瓶、、です "調味料の瓶。" そのようなケント科学によって供給としてラットのためのギロチン。 ビブラトーム1000： 縦に半分にカミソリの刃を切断、クランプに挿入し、アルコールで油を洗い流してください。 普通の砕いた氷と一緒にお風呂を埋める。 場所縦トレイ。 シアノアクリレートのドロップを配置する前に、水分のトレイを拭きます。 Rongeurs（例はMiltex、猫からMicroフリードマン骨鉗子ません。なし。または17から4801ファイン科学ツールcatからピアソン骨鉗子。ない16015から17）。 第3または第5宝石商鉗子（硬膜をやってのけることが鋭い）。 鋭いポイント（ヴァンテージV95-304は例です）と小さなハサミ。 （2）このようなバランススケールに粉状の化学物質を転送するために使用されるようにフラットステンレス製のミニへら、。終脳と頭蓋の間に収まるように幅広いエンドはように前方に曲げられている。 脳のブロックを転送するためのスプーン。 （カフェテリアからプラスチックスープ用のスプーンは正常に動作します。） SCALPEL＃10。 ダブルエッジかみそりの刃（炭素鋼）： ビブラトームための半分。 解離の半分。 二枚のガラスのペトリ皿、〜3.5インチ、直径4インチ、一方が他方の内部に収まるようにする。 bの砕いた氷ottom皿。一番上の皿の中で二つのフィルター紙。ろ紙を動かして好きな位置にスライスを移動します。 100ミリリットルのビーカー。 氷で脳に水を引くためのスポイトは、CSFを冷やし。 （1/2インチ幅のラテックスゴム球に挿入細いガラスパスツールピペットはうまく動作します。） 砕いた氷トレイ：10インチ、幅20インチ長い、約5インチ高。含まれています： 砕いた氷に含まれる全てのインストゥルメントを張ってください。 低カルシウム/氷を粉砕するために打ちましたができるプラスチック製のボトルで高マグネシウムACSF。 シアノアクリレート。 低カルシウム/高マグネシウム人工脳脊髄液（ACSF）： mm単位：125のNaCl、2.5のKCl、0.5のCaCl 2·2H 2 O、2.0のMgCl 2·6H 2 0、1.2のNaH 2 PO 4·H 2 O、25炭酸水素ナトリウム、グルコース11。 ペットボトルで氷を粉砕するために打ちましできる。 -80で20分間チル°スラッシュにそれを作るためにC冷凍庫。 綿棒。 ろ紙：ワットマン42.5ミリメートル（カタログ番号1001 042）。 組織の小さいセクションを収集するためのミニ遠心管。 ウェルズは、プレートより大きな構造と組織の切片を収集する。 ペーパータオル。 レッドバイオハザードバッグ。 麻酔： 麻酔瓶、ガーゼパッド、イソフルラン、金属鉗子は、ドラフト内に配置されている。 ラットは麻酔ジャーに入れています。 麻酔の瓶にイソフルランと場所とガーゼパッドを湿らせます。 ペダルの反射まで待って – ウェブは鉗子で挟まれて足の撤退 – あるいは角膜反射が消えます。 首をはねる：後ろから胸部周り片手でラットをつかみ、できるだけ後頭部に近いようにギロチンとラットを斬る。アトラスはまだ通常頭蓋骨に添付されたままになります。 採血：頚動脈から噴出から血を防止するために胸部におけるスクイーズラット。収集容器への血液の流れを制御するように徐々にグリップをリラックス。 脳の除去： 迅速に小さなはさみとbasiocciputから筋肉、残りの椎骨を切り取る。 大後頭孔に骨鉗子と始まりを使って、後頭顆とbasiocciputを切り取った。 メスで頭皮正中切開。 はさみを使って、後頭部と頭頂骨の中に半ば矢状切開を切った。 rongeursと頭蓋骨の切断マージンをつかみ、脳との接触を最小限に抑えるように注意して、正中線から離れて卵の殻のように戻って休憩。背面正中線カットや休憩を段階的に行うことができる。 脳がさらに露出しているように、それは組織の整合性と活力を維持するために氷冷蔵ACSFでそれを消すことが重要です。 同様に、時間的および前頭骨を脱却。 細かい鉗子で、取得することを確認し、硬膜を引き離すtentorum小脳。 前頭葉の下に挿入ミニスパチュラでちょうど十分な脳神経に張力を掛け、頭蓋から脳を育てる。 はさみを持つ脳神経を横断する。 頭蓋骨から完全に脳を持ち上げ、アイス低カルシウム/高マグネシウムACSFのビーカーにドロップしてみましょう。組織が固体になるように冷却する分以上を残して、はっきり見える構造、組織の健全性は維持されます。 プラスチックスプーンでは、氷冷蔵シャーレにろ紙上に腹側の脳を転送します。 脳の解剖： 中大脳動脈（ 図2A）でかみそりの刃で冠状切断を行います。 100mlビーカー中低カルシウム/高マグネシウムACSFを冷やして氷の中に一時的に前頭葉を保存します。 背面が上になるように脳を反転します。中脳の岐路に脳幹を横断するND diencaphalon。その結果、脳のブロックは、図2Bに見られている。 アイス低カルシウム/高マグネシウムACSFにブロック大脳バックドロップします。 ミニスパチュラを使用して、延髄/橋から小脳を解剖。意図された分析のための適切なメディアに保存します。 シャーレにブロックされ大脳を返します。 2ろ紙を用いて、ventrumに1ろ紙を置くことによって、脳を持ち上げます。それに伴い、第二フィルター紙の端にブロックされて大脳の前頭面後部に配置します。この濾紙場所ビブラトーム切削プレート上のシアノアクリレートのドロップでブロックされた大脳の前方切断面と、皮質は、ブレードに面しています。 ビブラトームで、ちょうど十分に尾側の脳の断つようhippcampusショー（ 図2C）。 セクション、125グラムのラットにおける厚い2400、μ、200gのラットにおける厚い2700μを取る。シャーレ上に濾紙上に綿棒を使ってセクションを転送（ 図2D）。 カットとかみそりの刃で帯状皮質を保存します。 歯科用スパチュラで、その後同種皮質剥がし、それをカットする脳梁の先端縁に押し込みます。 そのventolateralマージンから、海馬（ 図2E）はがす。 中脳を保存します。 200gのラットで2500μmの厚さの120グラムのラットで2400μmの厚さの2番目のセクションを、取る。ペトリ皿（ 図2F）でろ紙上のセクションを置きます。あるいは、5〜500μmでセクションが電気生理学のため、この時点で取ることができる。 カットとかみそりの刃で帯状皮質を保存します。 同種皮質（ 図2F）を除去するために内部のカプセルでかみそりの刃で横方向のカットを作る。 かみそりの刃で斜めカットがamygdali（ 図2F、G）を削除することを確認します。 視床下部を削除するには、かみそりの刃でカットボックスを作成します。ラテラルカットが見えるようになり、視床下部の腹内側核、側方にあります。我々は、ちょうど第三脳室または腹側被蓋野（ 図2H）上記背カットを行う。 脳梁にへらを押して、海馬に接続されている同種皮質の小片を引き離す。海馬交連に腹へらの狭い方の端を置き、海馬をやってのける背上げます。 脳組織と血液サンプル中のRNAとタンパク質の保存： RNAアッセイのためのメディア： 脳：RNAlaterでRNA安定化試薬、エッペンドルフチュー​​ブの＃76106。 血液：パクスジーンRNAチューブ（PreAnalytix、Quagen）。 血液からのタンパク質（CORT）アッセイのためのメディア：液D-HBSS、W / O型のCa2 +およびMg 2 +、（品質バイオ株式会社）。 ストレージ： 収集された脳組織が最初に12以上時間ドライアイスのバスケットに保存され、その後、-70℃の冷凍庫で6ヶ月、研究の期間内で使用するため。 採取した血液は、それが6ヶ月以内に使用するために-70℃の冷凍庫、試験期間中に格納された後、試薬が浸透できるように、室温で一晩保持されます。 3。ミトコンドリアとミトコンドリア関連核遺伝子の遺伝子マイクロアレイ脳組織におけるラットミトコンドリアの機能を研究するために、我々は最近、ラットミトコンドリアニューロンに焦点を当てマイクロアレイ（rMNChip）と脳組織18の差動経路の迅速な同定のためのバイオインフォマティクスのツールを開発しました。 rMNChipは、ミトコンドリア機能、ストレス応答、概日リズムとシグナル伝達に関与する1500の遺伝子が含まれています。バイオインフォマティクスツールは、発現差のある遺伝子のコンピューティングのためのアルゴリズム、およびマイクロアレイの結果のために簡単で直感的な解釈のためのデータベースが含まれています。 Purificatio組織からの全RNAのn（カタログ番号GPM-2011から1キット、GenProMarkers）： RNA中の特定の原子核のラットの脳組織は、 後の安定化試薬（Qiagen）RNA。 Dispergierstation（IKA株式会社更新）にウルトラツラックスT8を使用して組織（600μlのGPM-L / B緩衝液中の30 mg）を均質化。 15分間ソーバル21000 rpmで1.5 mlチューブで遠心分離します。 2mlのコレクションチューブとスピンカラムに上清をデカントします。 3分間15,000 rpmでカラムチューブを遠心し、フロースルーを捨てる。 スピンカラムのそれぞれに700μlのGPM-B / Wバッファを追加し、フロースルーを捨てる、15秒間、16,000 rpmでカラム遠心する。 スピンカラムのそれぞれに500μlのGPM-W緩衝液を加え、一度繰り返し、15秒間、16,000 rpmでカラム遠心する。 新しい1.5 mlのコレクションチューブにスピンカラムを配置します。 スピンカラムのそれぞれに30μlのDEPC処理水を加え、16,000 rpmで遠心1分、一回繰り返します。 RNA濃度を測定するには、DNase-＆RNaseフリー水で1μg/μLの濃度を調整するには、サンプルはマイクロアレイのラベリングの準備ができている。 マイクロアレイ標識およびハイブリダイゼーション（カタログ番号アレイ900、Genisphere）： 1.0μgのラットの全RNAを、製造業者の指示に従ってcDNA合成、マイクロアレイ標識に使用されています。 前述のように、マイクロアレイハイブリダイゼーションは12から16時間65℃でrMNChipに行われている。18 （カタログ番号GPM0101-6、GenProMarkers）ハイブリダイズしたマイクロアレイスライドを洗浄した： 洗浄液 ボリューム 20×SSC 10％のSDS ddH 2 Oを 0.5×SSC/0.01 SDS 500ミリリットル 12.5ミリリットル 0.5ミリリットル最大500 mリットル 0.5 X SSC 500ミリリットル 12.5ミリリットル最大500 mlまで 0.1×SSC 500ミリリットル 2.5ミリリットル最大500 mlまで 0.01×SSC 500ミリリットル 0.25ミリリットル最大500 mlまで 洗浄中にスライドを光から保護されるべきである。スライドは、任意の段階で乾燥させないようにしてください。 BioShaker（モレキュラー·テクノロジーズ社、ミズーリ州セントルイスにjarを攪拌することにより、室温で：ガラスコプリンジャー（70312から20、電子顕微鏡学、ハットフィールド、ペンシルバニア猫＃）で250mlの溶液1のスライドを洗う）カバースリップの全てまで、スライドガラスを（それは<3分かかります）落ちる。 3分間瓶を撹拌することにより、別のJARに250mlの溶液2とスライドを洗浄します。 250mlのソリューション3でスライドを洗浄します二回この手順を繰り返し、3分間瓶を回転させて別の瓶インチ 10秒のために、別のJARに250mlのソリューション4でスライドを洗浄します。直ちに5分間1,000 rpmでソーバルスーパーT21遠心分離機でPN11779プレートとST-H750ローター上に置かjarを遠心分離することにより、スライドを乾燥させてください。 できるだけ早くスキャンするためのボックスで洗浄したスライドを配置します。 マイクロアレイ画像のスキャンと分析取扱説明書以下ScanArrayエクスプレスマイクロアレイスキャナー（PerkinElmer）を使用していて、に焦点を当てる： マイクロアレイイメージスキャン：プロトコルをスキャン対簡単スキャン。 データアウトカムに対するレーザパワー、PMTと正規化方法の影響。 画像にGALファイルの整列。 正確にグリッドへのスポットの位置合わせ。 データ解析：マイクロアレイデータ解析のためのカスタマイズされた計算手順は、マイクロアレイ画像の評価、データフィルタリング、スポットサイズ補正、インクルージョン、normalizatioを含めるnとの比較は、以前に説明した18。再現性があり、検証可能なマイクロアレイの結果2、22、25、19、20、8、23、18の生成を確実にするために、前述したようにまた、オントロジー、経路およびネットワーク解析のための手法は同じです。 4。採血および血漿CORT濃度測定麻酔した動物からの前または後ストレス尾血液サンプルを循環CORTのレベルの測定のため、デイ1でヘパリン化チューブに14、21、30に収集されます。 動物は安楽死させた後、トランクの血液サンプルもヘパリン化管に収集されています。血漿は分析まで-70℃で抽出され保存されます。 血漿抽出のためのメディア： RNA抽出のための血液サンプルはパクスジーンRNAチューブ（PreAnalytix、Quagen）を使用して収集されます DNA抽出のための血液サンプルはパクスジーンDNAのチューブ（PreAnalytix、Quagen）を使用して収集されます。 </lI> タンパク質分析のための血液サンプルはMaketLab＃ML5601からヘパリンリチウム、キャピラリーコレクションチューブ（200μl）を使用して収集されます。 プラズマCORT濃度は、ActiveラットコートEIA（診断システム研究所社でテストされ、分析されhttp://www.beckmancoulter.com/次のように）： 使用するマイクロタイターストリップをマークします。 共役希釈剤中のラットCORTの酵素複合体濃縮液を希釈することにより、ラットCORTの酵素複合体溶液を調製する。 ウェルにピペット25μLの標準、コントロール、未知数。 半自動ディスペンサーを用いて各ウェルに100μlの酵素複合体溶液を加える。優しくよくホルダー5から10秒をタップします。 各ウェル半自動ディスペンサーを用いて抗血清を100μlのラットCORTを追加します。 60分間500から700 rpmでシェーカーセットに、室温、25℃でウェルをインキュベートする。 各WELを吸引除去し、洗浄自動マイクロプレートウォッシャーを用いて洗浄溶液でlは5回。吸収材の反転板でドライ拭き取ります。 よく半自動ディスペンサーを用いてそれぞれにTMB発色液100μlを添加する。 500から700 rpmに設定オービタルマイクロプレートシェーカー上で室温15〜20分間インキュベートする。色の変化を監視します。 半自動ディスペンサーを用いて各ウェルに100μlの停止溶液を加える。 手5から10秒までに板を横に振る。 30分以内にウェル内の溶液の吸光度を測定します。 フィルターは、450nmに設定されています。 * EIAキットはまた、免疫生物学研究所（で購入することができますwww.ibl-america.com ）。 5。代表的な結果 図1ラットを拘束され尾ショックにさらされている。その後の体重、血漿コルチコステロン濃度、および音響驚愕反応が測定されています。ストレス曝露：動物を換気プレキシガラスチューブに固定化されることによって抑制される。四電気ショックは、（2ミリアンペア、3秒持続;)は150から210秒BとCの半ランダムな間隔でしっぽに配信されています：。成長時の体重のストレスを遅らせるゲイン：体重および摂餌量および摂水量測定されそこに14日目までの直後のストレスの3日の日にストレス（日-3​​）に先立ち、その後隔日。ストレス時の体重のゲインの欠如が補償されることはありませんD：ストレスの増加、血漿コルチコステロン濃度のE：アコースティック驚愕：動物の最終日後にベースラインの読みと12日などのストレスの前に1日（日-1）をテストされていますストレスの連続した​​3日間。ストレスとコントロール – – 各グループのデータは、音響のパーセントとして表現さ​​れている-1日の12日目相対で驚愕。ストレスは著しく音響驚愕反射を増加させます。 拡大図を表示するにはここをクリック 。 図2に、扁桃体、海馬、脳スライスからの視床下部の解剖：。ラット脳、腹ビュー：中大脳動脈の矢印は、ポイントB：ビブラトームへ輸送する準備ができて脳のブロック、腹ビュー、。 C：ビブラトームトレイに接着脳ブロック、尾側まで、ブレード対向皮質。尾側の脳は既に尾海馬をさらす切り取られています。ブロックは現在2500程度が取られるべき海馬の主要な部分を含むスライスの準備ができているD：は 。尾海馬を含む2500μmの厚さのスライス、E：T彼同種皮質機構（ISO）が海馬（HC）と中脳から剥離海馬から剥離されるF：。扁桃体と海馬を含む吻側2500μmの厚さのスライスがG：同種皮質を摘出されていて、扁桃体（Amyg）切除、H：視床下部は（HT）を切除して、ずれている。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。 図3：グルココルチコイド受容体（GR）と扁桃体のminerocorticoid受容体（MR）、海馬、視床下部、および前頭皮質の前に（C、コントロール）および後（STR）テールショックストレスのmRNAの発現レベル。ユニットは、コントロールの割合です。バーはSEMである：扁桃体：ストレスがminerocorticoid受容体mRNAの発現を低下させるB：海馬：ストレスincrea。SES minerocorticoid受容体mRNAの発現C：視床下部：ストレス増加minerocorticoid受容体mRNA発現D：前頭皮質：ストレスは、グルココルチコイド受容体mRNAの発現と同様minerocorticoid受容体mRNAの発現を減少させます。 ラットGR用（121bp）のPCRプライマーは以下のとおりです。 1f.CCACTGCAGGAGTCTCACAA 1rAACACCTCGGGTTCAATCAC ラットMRの（99 bp）をPCRプライマーは以下のとおりです。 1f.GCCTTCAGCTATGCCACTTC 1rAACGTCGTGAGCACCTTTCT 図4クラスタおよびRNAのヒートマップは、差小脳（CL）は、大脳（CR）は、前頭皮質（FC）、視床下部（HT）と海馬（HC）を含む5ラット脳組織由来の64遺伝子から発現した。カラーマップは、dの倍の変化を示している自社（緑）とアップ（赤）に発現している遺伝子。これらの5つの脳組織のための15のマイクロアレイ実験から派生64遺伝子の各々のための9の測定値の正規化された信号強度の（）クラスタおよびヒートマップ。各遺伝子の発現は、技術的および実験三重三重で測定した。 （B）は64遺伝子の各々のこれらの9回の測定の平均RNAレベルのクラスタおよびヒートマップ。これらの結果は、ミトコンドリアの遺伝子発現における明確な違いや異なる脳領域は、異なるエネルギー需要を持っているという我々の仮説を支持したがって関連する関数を示している。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。 小脳（CL）、大脳（CR）は、前頭皮質（FC）を含む5ラット脳組織由来のRNAを用いて、発現差の64遺伝子のクラスターとヒートマップの同定につながっrMNChipとバイオインフォマティクスツールの我々のアプリケーション、hypothalamus（HT）と海馬（HC）（ 図4）。これらのデータは、ミトコンドリア遺伝子発現、したがって、関連する機能の明確な違いを示しています。結果は、異なる脳の領域が、対応する脳の機能を遂行するためにエネルギーの異なる量を求めることを実証している。