Laminer Akış Kesme Stres altında endotel progenitör hücrelerin değerlendirin Paralel plakalı Akış Odası ve Sürekli Akış Devre

1. Endotelyal progenitör hücre izolasyonu Periferik insan kanı herhangi bir tahsilat önce araştırma protokolü, Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) göndermek ve onun onayı alındıktan sonra, gönüllü donörlerin almak 'bilgilendirilmiş onam (periferik kan toplama ve EPC izolasyon ve Duke Üniversitesi IRB tarafından onaylanmıştır insan araştırmaya katılanların korunması ile ilgili) ABD düzenleyici gereksinimleri ile tam bir uyum içinde. Hayvansal kaynaklı EPC ile çalışırken, Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanan araştırma protokolü Komitesi (IACUC) kullanın. Tüm porcine deneyler Duke Üniversitesi IACUC tarafından onaylanmıştır ve insancıl bakımın en yüksek standartlara uygun olarak yapılmıştır. Endotelyal progenitör hücrelerin izolasyonu için razı bir gönüllü donör standart flebotomi tekniği ile antikoagülan Sitrat ile dolu kan toplama torbaları içine 50 ml periferik kan toplamake fosfat dekstroz ve Hank tamponlu tuz solüsyonu ile 1:1 (CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4 hariç) ve Histopaque eşit hacimlerde katman iyi tanımlanmış katmanlar oluşturmak için çözeltinin. Santrifüj (30 dk, 740 g, düşük bir kırılma ayarı) ve mononükleer hücre (MNC) (buffy coat) katmanı toplamak. Tam EPC büyüme orta iki 12-iyi tabak içine kaplama öncesinde yeniden süspanse edin ve Dulbecco'nun Fosfat yıkama ÇUŞ'larının x 3 (MCDB-131 orta 5 ile% 10 Fetal Bovine serum (FBS) x 10 dakika, 515 gr (DPBS) Tuzlu Tamponlu 37 ml 200 mM L-glutamin,% 10 FBS ve EGM-2 SingleQuots) ° C,% 5 CO 2. Yavaş yavaş daha sonra ilk 7 gün, her gün için her 24 saatte bir, orta değiştirin. EPC koloniler, arnavut kaldırımlı morfolojisi dayalı bir ortalama süre 14 gün sonra tespit edilebilir. 12-iyi bir yüzey alanı kültür kapak ¼ EPC, hücreleri genişletmek ve yüzey belirteçlerinin varlığı için test sitometrisi ile EPC kimliğini onaylamakCD31 ve CD14, CD45 yokluğu daha önce 6 açıklandığı gibi. Diğer testleri yapılabilir hücre morfolojisi ve DII-Ac-LDL ile etiketleme. Burada anlatılan deneyler yaklaşık 37 nemlendirilmiş bir inkübatör EPC orta 3 T-75 hücre kültürü şişeleri konfluent kadar izole EPC genişletin ° C,% 5 CO 2. 2. Kesme gerilmesi hesabı Biz bu hesaplamaları elde edilebilecek koşullarının bir anlayışa sahip odası ve kanal imalat önce yapılır öneririz. Istenilen kesme devresinde perfüzat akış oranını hesaplayın, denklem 1 1 göre hücrelere uygulanacak vurgulamaktadır Q istenen akış hızı nerede, τ hedef shücreleri üzerinde stres teğet hareket duymak, akış odasının genişliği w, h, akış odasının yüksekliği ve μ perfüzat (akış orta) viskozite . Kullanılan orta tipik bir viskozite değeri (μ) 0.9 cP (0.009 g cm -1 s -1). Viskozite de bu yüzden 7 istenirse, yüksek molekül ağırlıklı dekstran kullanarak gündeme olabileceğini unutmayın. Tipik bir hedef kayma gerilmesi değeri (τ), fizyolojik üstü kayma stres isteniyorsa, 15 dynes / cm 2, (tipik arter kayma gerilmesi) veya 100 dynes / cm 2 kullandı . 267 mikron – Odamızca genellikle 166 aralığında, 1.9 cm ve yüksekliği (h) bir genişliği (w) vardır . 3. Akış odasına üretim Kesme inci alt ve üst plakalar7 x 2 x 0.5 "7 x 2 x 0,25 ve alt boyutlar" üst boyutu ile alüminyum alaşım 6061 dikdörtgen e odası. Recess sonunda ortalama 0.125 1.375 "genişlik x 0,3125" derin sıvısı deposu için "derin, 0.950 bırakarak" orta kısmında üst plakası. Alt 1 / 16 "genişlik x 0.625" uzun yuvaları, giriş ve çıkış uçları rezervuar nüfuz için delin. Sonunda her bir üst plaka, sıvı rezervuar nüfuz hortum barbus merkezi bir 10/32 "polipropilen 1 / 8 inç başına parça (TPE) delik" delin. Girişinin sonunda, "polipropilen 1 / 8 delikten TPE" hortum barbus 10/32 ile yan fiş oluşturmak. 0,518 derece sıvı karışım yeterli sıvı girişi cam görüntüleme penceresi Konik üst alt. Içine bir bardak slayt penceresinin üst görüntüleme penceresi doğrultusunda alt plaka kesin. Odasına akvaryum çimento, yapıştırıcı bir cam slayt kullanma. En az 24 saat süreyle tedavi etmek için izin verin.Izleme penceresi, 75 x 25 x 1 mm mikroskop cam slayt odasında gömme oturup o kadar gömülü olduğu olun. "0.02 arayla olduğu gibi alt ve üst plakalar alt etrafında bir O-ring için bir oyuk oluşturun. Lastik O-ring yerleştirin. Düz başlı vidalar "8 / 32 ile kullanım için alt ve üst odaları TPE delikler" 10 uyan 8 / 32 delin. 4. Akış devre montaj Önce tüm akım devresi birleştirin, daha sonra kendi sterilizasyon ile devam edin. "(Bağlantı darbe dampener bir ucundan 1 / 8 ile) sabit boru segmentinde" 36 takın. Diğer ucunu için, yumuşak bir boru 18 "segmentinde takın. Adım 4.2 'de belirtilen yumuşak tüp bölümü 1 / 8 "(18) sonunda erkek luer adaptör," yerleştirin. 1 / 8 erkek luer Bağlan "kadın döner adaptör yeni bir 18 dişi luer takın" segment yumuşak bir tüp. Tüp sığdırmak için 250 ml cam beher kap içine üç delik delin. Benbir delik ve serbest uçları, 250 ml cam şişe (rezervuar) (Şekil 2) içine kap içinde diğer 2 deliklerden sert ve yumuşak tüp içine yumuşak bir boru 1.5 "segmentinde nsert (hava havalandırma gibi ). sert boru (rezervuar çıkışı boru), rezervuarın alt ulaştığı olun. 121 ° C'de 60 dakika buhar otoklav ile yukarıdaki parçaları sterilize. Ayrıca, otoklav bir tam akış odası, 3 x 2 Luer adaptörü, 4 x ½ "segmentleri yumuşak hortum, 1 erkek ve 1 kadın 1 / 8" ve 6 x 5 / 16 "8-32 düz başlı vida, cımbız, 1 çift , bir 75 x 25 x 1 mm cam slayt (ya da istenen başka bir hücre yüzey malzemesi), ve 2 cerrahi havlu. Laminer akış kaputun içine steril havlu yerleştirin. Bu steril sahaya akım devresi, akış kamara, 4 x 4-yönlü stopcocks, 1 x 1-yönlü stopcock ve 4.5 adım tüm steril parçalar yerleştirin. Şimdi iki 4-yol stopcocks bağlamak için steril eldiven kullanın. Kapakları açık örnek limanları Yeri. </li> Akım devresi iki yumuşak boru bölümleri ekleyerek, erkek ve dişi luer adaptörleri çıkarın ve bağlı stopcocks (Şekil 3) takın. 30 ml şırınga rezervuar içine takılan yumuşak boru takın ve şırınga pistonu kaldırmak. EPC orta (Şekil 4) 125 ml şişe doldurun. Steril bir şırınga filtre havalandırma (Şekil 4) içine yerleştirin. 37 nemlendirilmiş bir inkübatör içine akım devresi Taşı ° C,% 5 CO 2. Sabit boru, boru bu tür (Şekil 5) ile kullanmak için belirtilen roller pompa kafası içine sıkıştırın . Boru roller pompa montaj parçaları ile üst üste gelmez emin olun. Hortumun Mark nerede bir işaretleme kalemi ile her iki tarafında pompa kafası çıkar. Tüm stopcocks örnek limanlarına doğru yola kapalı olduğundan emin olun ve akım devresi boyunca açık. Pompayı başlayın. Akış yönünü kontrol edin. Perfüzat fr hareket etmelidirom darbe tav içine sabit hatlar aracılığı ile cam rezervuar. 5. EPC floresan etiketleme Akım devresi ısıtır 37 ° C, slayt üzerine tohum hücreleri hazırlarken. Hücreleri opak malzemeler, örneğin titanyum (Ti) görüntülenebilmekte, floresan etiketleme gerekli olduğunu unutmayın. 90 ul dimetil sülfoksit (DMSO) ile seyreltilmesi ile 50 mikrogram CTO toz Hücre Tracker Orange (CTO), 1 mM stok solüsyonu oluşturun. Işığa maruz kalma (akış kaputunun altında çalışırken ışık söner) bu karışımı kalkan emin olun. 18 ml serum serbest MCDB-131 orta CTO stok solüsyonu 36 ul seyreltilmesiyle CTO 2 mcM çalışma çözüm oluşturun. Konfluent T-75, 10 ml DPBS (Ca ve Mg olmadan) hücre kültürü şişeleri yakın 3 EPC durulayın. Her balona 2 mcM CTO çalışma çözümü 6 ml ekleyin. 37 az 15 dakika boyunca inkübe ° C 10 ml DPBS (Ca ve Mg olmadan) Her balona x 2 durulayın. <li> Her balona 4 ml tripsin ekleyin. 37 ° C'de 3 dakika. 8 ml tripsin Nötralizasyon Çözüm nötralize. 600g ve tekrar süspansiyon santrifüj EPC orta 5 ml x 5 dakika yıkayınız. 6. Odamız meclisinin akış önce slayt Hücre tohumlama Cam, titanyum, ya da diğer malzemelerin yapılmış bir slayt ve slayt yüzeyi polimer ile spin kaplama ile değiştirilmiş ya da metal bir tabaka ekleyerek olabilir. Slayt dört odacıklı steril bir dikdörtgen hücre kültürü gemi (ya da polistren yüzey isteniyorsa kullanımı doku kültürü slayt şişesi) içine yerleştirin. EPC orta x 6 saat 5 ml konfluent bir hücre katmanı, akış başlatılması (Şekil 11A) isteniyorsa slayt üzerine, hücreler ve tohum 1.5 x 10 6 hücre Kont. Yayılan hücre ve yapışma sıvı kayma stres altında test etmek için, 3 x 10 6 hücre akışı başlamadan önce (hızlı-ekim) sadece 15 dakika için uyması izin ( <strong> Şekil. 11B). 7. Akış odamız meclisinin Steril eldiven kullanarak, kadın döner adaptör "yumuşak boru segmentinde 1 / 8" bir 2 takın. Erkek luer adaptörü başka bir 2 "1 / 8 yumuşak boru segmentinde" bağlayın. "Yumuşak boru girişi bağlantı noktasına kadın döner adaptör ile 2 takın" 2 takın erkek luer yumuşak boru çıkış portuna. 4-yol stopcocks bu luer adaptörleri de takın. Kalan 2 "yumuşak bir boru parçası balonu tuzak çıkıyorsa yan port konnektörüne bağlayın ve 1-yönlü stopcock takın (Şekil 6). Steril bir pens kullanarak, hücre kültürü gemi (ya da bir slayt şişesi kullanarak, slayt balon kaldırmak), hücre numaralı seribaşı slayt kaldırmak ve akış odasının alt plaka üzerinde girinti içine yerleştirin. Slayt hücre numaralı seribaşı yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirildiğinden emin olun. Slayt üzerine sıcak EPC orta pipetleyin 10 ml. Orta slayt ve akış odası, b karşılamak için izin verinut alt plakası O-ring üzerinde orta dökmeyin. Vida deliklerini hizalayarak alt plakası üzerine akış odasının üst plaka yerleştirin. Iki tabak paralel tutarak bu adımı sırasında odasına hava kabarcıkları tanıtmak için özen gösterin. Birlikte Vida levhalar (bu işlemi otomatik olarak pille çalışan bir tornavida hızları). Girişi kabarcık tuzak girişi tarafında baloncuk tuzak bağlantı noktasına bağlı 1-yönlü stopcock açarak içindeki hava kabarcıklarını çıkarın ve yavaşça girişi tüp 10 ml şırınga kullanarak EPC orta ile yıkayın. Sonra bu valfli ve bu kap (Şekil 7) kapatabilir. Şimdi, 4-yönlü stopcock çıkış portu açarak ve yavaşça 10 ml şırınga kullanarak tekrar akış haznesinden EPC orta kızarma oda kanal içindeki hava kabarcıklarını çıkarın. Büyük kabarcıkları kalırsa, 45 derecelik bir açıyla (Şekil 8) odanın çıkış ucunu yükseltmek. Cap 4-yönlü stopcock bağlantıları ve yakınonları. Monte akım devresi (Şekil 9) inkübatör içine akışını odasına taşıyın. Akış devresi pompası Pause. Kaçağı önlemek ve odanın içine steril tutmak için akış yönünde akış devre stopcocks kapatın. Akım devresi akışını kaput akışını odasına taşınması. Akım devresi akışını odasına bağlayın. Akış yönü stopcocks açın. Akış pompası devam edin. Perfüzat doğru yönde akar emin olun. Istenen kayma gerilmesi akış hızını ayarlayın. Akışını deney sırasında, ışık veya floresan mikroskobu ile görüntü akışını odasının devre hücreleri kaldırıldı olabilir. Bunu yapmak için, stopcock-valfli bağlantıları akım devresi akışını odası bağlantısını kesin. Odanın sterilite korumak için, akış yönünde akış devre stopcocks ve akış odası stopcocks kapatabilir ve akım devresi çıkarmadan önce bütün stopcocks kapinkübatör (Şekil 9). 8. Perfüzat örnek toplama Kolay toplama, analiz için perfüzat numuneler (örneğin, nitrik oksit sentezini), ilk pompa duraklatmak için. Darbe tav yakın bulunan stopcock kapatın. Koruyucu kapağı çıkarın ve küçük boyutlu bir şırınga, örneğin 3 ml şırınga, örnek portuna takın. Kap tutun ve ters yerleştirerek kirlenebilir olmayacak sağlamak. Darbe dampener açık yönde örnek liman ve devre tutarak, akış odasının yönünde stopcock kapatın. Devre örnek istenilen miktar, örneğin 150 ul çizin. Şırıngayı çıkarmadan önce örnek limana doğru stopcock kapatın. 80 ° C (nitrik oksit belirlenmesi için daha sonraki bir zaman noktasında) – etiketli şişe ve dondurma perfüzat örnek saklayın. Recap örnek bağlantı noktası ve tüm stopcocks başlamadan önce açık olduğundan emin olun akar. 9 – Temsilcisi sonuçları Insan kan endotel progenitör hücrelerin hızlı tohumu yöntemi kullanarak, 15 dakika boyunca titanyum Slaytlarınıza numaralı seribaşı ve 15 dynes / cm 2 fizyolojik (arter) kesme kuvvetleri altında uymak olabilir. Şekil 10'da gösterildiği gibi, EPC 657 tohumlama hemen sonra, 210 akış etkisi ± 11.4 mikron 2 altında yayılmış, 3 saat sonra ve 1152 ± 39.1 mikron 2 ± 55.3 mikron 2, 15 akışkan kayma gerilmesi, 24 saat sonra dynes / cm 2 (gruplar arasındaki fark p <0.0001, 1-yönlü ANOVA ile istatistiksel olarak anlamlı). Hücre alanı, ışık veya floresan mikroskobu ile şeffaf oda üzerinden görüntülü olabilir artmasına paralel olarak, yuvarlaklık denklemi 2 6 göre hesaplanır / Files/ftp_upload/3349/3349eq2.jpg "/> 878 x 10 -3 ± 5.9 671 x 10 -3, tohumlama hemen sonra, x 10 -3 ± 19.2 x 10, 3 saat sonra -3, ve 526 x 10 -3 ± 19.2 x 10 -3 sonra 48 saat azaldı Aynı sıvı kayma gerilmesi maruz kalma (gruplar arasındaki fark, p <0.0001, 1-yönlü ANOVA ile istatistiksel olarak anlamlı ). Şekil 11D EPC 15 dynes / Şekil 11A gösterilen statik tohumlama süresi, 6 saat sonra kendi rastgele yönlendirmeye göre 2 cm sıvı kayma gerilmesi 48 saat sonra akış yönü hizalayın ve şark göstermektedir. Bizim yöntemi de perfüzat örnekleri analiz ve / veya salgılanan hücre metabolitleri ölçümü için önceden belirlenen zaman noktalarında elde etmek için izin verir. Temsili bir örnek olarak biz üretimi tasvirŞekil 12 domuz EPC ile 48 saat akış deney sırasında nitrit ğünü (NO 2). Biz doğrudan doğruya, 6 saatte 12.0 nmol, 13.1 nmol 12 saat, 24 16.3 nmol akım devresi için farklı zaman noktalarında toplanan orta örneklerinde NO için bir belirteç olarak ölçülen nitrik oksit (NO) bu birincil oksidasyon ürünü saat ve 15 dynes / cm 2 6 1 x 10 6 hücre için 48 saat sonra 24.6 nmol. Şekil 1 akım devresi montaj ve akış deney gösteren şematik bir bakış. (A) akış kabinsiz Akış devre montajı. Rezervuar, darbe dampener, sert tüp, yumuşak boru, 4-yönlü stopcocks ve bağlı döner adaptörleri, hava filtresi gibi burada dahildir. (B), akış pompa kafası sabit boru segmentinde üzerinden akış odasına bağlanması . (C) akışını odası (D) alt plakasına EPC numaralı seribaşı slayt sertion. Akış odasına akım devresi montaj tamamlayın. Sterilizasyon için Şekil 2 Tamamen monte akım devresi. Şekil 3. stopcocks ile sterilizasyon Montajlı akım devresi sonra. Şekil 4, 125 ml EPC orta cam rezervuar Dolum . Şekil 5. Akış devre akış odasına ekleme önce akış pompa kafası içine kelepçeli. jpg "/> Şekil 6. En oda plakalı. Şekil 7 odasının girişi tarafında kabarcıklar çıkarmak için EPC orta balonu tuzak Flushing. Şekil 8, slayt ve odanın çıkış tarafında kabarcıklar çıkarmak için EPC orta odasının Flushing . Şekil 9, bir akış deney sırasında takılı akış odasına tamamen akım devresi toplandı . Şekil 10 EPC alanı (2 mikron) akış deney süresi boyunca artar. files/ftp_upload/3349/3349fig11.jpg "/> Şekil 11 (A) HUCB EPC Işık mikroskop görüntü 100 x büyütme akışı x 6 saat önce fibronektin kaplı cam slayt üzerine numaralı seribaşı. (B) HUCB floresan mikroskobu ile görüntülendi, 100 x büyütme üzerine CTO ve hızlı numaralı seribaşı Ti slayt akışına önce x 15 dakika ile etiketlenmiş EPC. (C) HUCB EPC ile aynı Ti slayt altında olarak (B), 100 dynes / cm 2 akış 3 saat sonra ve 100 x büyütme şeffaf oda yoluyla görüntülenmiş . Akış 3 saat sonra hücrelerin yayılmasını yine rastgele fakat yönlendirme unutmayın. (D) x 100 büyütmede akış maruz kalma 48 saat sonra aynı Ti slayt. EPC, CTO ve hücre çekirdekleri akış sonra Hoechst boyası (mavi) ile boyandı ile etiketlenmiş. Akış yönü hücre hizalama Not. (E) Domuz Ti üzerinde karşılaştırma için EPC akışı 48 saat ve 15 dynes / cm sonra <sup> 2 kayma gerilmesi maruz. Hücre sınırları PECAM anti-leke (yeşil) ve Sytox Turuncu Nükleik Asit boyası ile çekirdekleri ile boyandı. Akış yönü hücre uyum unutmayın. Şekil 12 Grafik, 48 saat boyunca akış domuz EPC NO üretimini gösteriyor . NO birincil oksidasyon ürünü, nitrit (NO 2 -), NO akışı sırasında farklı zaman noktalarında toplanan orta numune için bir belirteç olarak ölçüldü. Şekil 13 akış odası (A) 0,5 olmak "x 2" x 7 "üst kısmında ve alt kısmında (B) 0.25" boyutlarında x 2 "x 7", alüminyum alaşım 6061 dikdörtgen yapılır. Üst"sızdırmazlık için düzlük sigortalamak amacıyla, üst kısmı 0.125 merkezi kısmında gömme" rendelenmiş 0.45 alt O-ring temas yüzeyi x 1.375 "sıvısı deposu" 0,3125 için başına sonuna "0.95 bırakan. üst bölümde rezervuar 3/8-24 TPE ve dişli paslanmaz çelik uçları almak için 0.25 "derin dişli. "X 0.625" 1 / 16 ölçüm Yuvaları, rezervuar nüfuz alt içine işlendi. Girişinin yan fişi bir stopcock eklemek için hortum barbus 10/32 "1 / 8 için bir polipropilen ile delik" vardır. Her ünite sonunda 0.45 "x 2" uç hortumu barbus "1 / 8 için bir polipropilen derin kısmı" 0,25 ile merkezi bir dişli 10/32 TPE vardır. Bu konik "konuları alt delik rezervuar nüfuz yoluyla üst bölümünün alt konik bir alana 0,6875" biter 0,07, 1,460, bir mesafe "için bir LH yuvası merkezden 0,518 derece, geniş. cam sonunda "0,6875" genişlik x 0,0118 "derin ve 0,590 düz bir alan için karışımları(veya diğer yüzey, örneğin titanyum slayt) girinti. Slayt yüklendikten sonra bu düz cam (veya başka bir yüzeye, örneğin titanyum slayt) ile aynı hizada olmalıdır. Konik ve düz parlatılmış. Slayt yüzey 0,0118 "0,0118" girinti alt yüzeyinden gömme rezervuar yuvasına RH ucunda devam ediyor. O-ring, tamamen orijinal yüzey arasındaki O-ring groove ve slayt "0.020 bırakarak yuvaları ve slayt etrafında gömme üst ve alt birimleri on delik delinir. Üst bölümde 8 / 32 TPE gömme düz boşluk delik bulunur başlı vida. alt kısmında delikler, üst deliklere uyan yerleştirilen ve 8 / 32 TPE diziliyor alt birim hücre yüzeyinde cam slayt (veya titanyum slayt) üzerinde bulunan yüzeyi ile açık bir cam slayt pencere gömme floş birim , orijinal yüzey alt slayt ve iç O-ring oluk arasında "0.04 terk genişliği ile üst birim yuvası kapsar O-ring oluk vardır. O-rings kırmızı silikon AS568A, üst bölüm ve 046 alt bölümü için 044 Dash Numarası.