Piatti paralleli Camera Flow e circuito a flusso continuo per valutare le cellule progenitrici endoteliali sotto sforzo di taglio a flusso laminare

1. Isolamento delle cellule progenitrici endoteliali Prima di qualsiasi raccolta di sangue periferico umano, presentare il vostro protocollo di ricerca al tuo Institutional Review Board (IRB), e dopo la sua approvazione, ottenere dei donatori volontari 'consenso informato (la raccolta del sangue periferico e l'isolamento EPC era stato approvato dalla IRB Duke University e è in piena conformità con i requisiti normativi degli Stati Uniti in materia di protezione dei partecipanti alla ricerca umana). Quando si lavora con derivazione animale EPC, avere il vostro protocollo di ricerca approvato dal Animal Care istituzionale e uso Committee (IACUC). Tutti i nostri esperimenti suina era stato approvato dalla Duke University IACUC e sono state condotte in conformità con i più alti standard di cura umano. Per l'isolamento di cellule progenitrici endoteliali, raccogliere 50 ml di sangue periferico tramite la tecnica salasso standard da un donatore volontario acconsentito in sacchetti di raccolta del sangue riempito con il citrato di anticoagulantefosfato e destrosio e diluire la soluzione 1:1 con soluzione salina tamponata di Hank (senza CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4) e lo strato di volumi uguali di HISTOPAQUE per creare livelli ben definiti. Centrifuga (30 min, 740 g, l'impostazione pausa bassa) e raccogliere l'cellule mononucleate (MNC) (buffy coat) layer. Risospendere e lavare multinazionali x 3 con fosfato Dulbecco Buffered Saline (DPBS) con 10% siero fetale bovino (FBS) x 10 min, 515 g, prima di placcatura in due da 12 pozzetti in piena mezzo di crescita EPC (MCDB-131 di media con 5 ml di 200 mM di L-glutamina, 10% FBS e EGM-2 SingleQuots) a 37 ° C, 5% di CO 2. Lentamente cambio medio ogni 24 ore per i primi 7 giorni, poi a giorni alterni. Colonie EPC possono essere identificati dopo un tempo medio di 14 giorni in base alla loro morfologia ciottoli. Una volta EPC in ¼ coprire cultura del 12-bene la superficie, espandere le cellule e confermare l'identità EPC con citometria a flusso da test per la presenza di marcatori di superficieCD31 e l'assenza di CD14, CD45 come descritto in precedenza 6. Altri test che possono essere eseguite comprendono morfologia cellulare e di etichettatura con DII-Ac-LDL. Per gli esperimenti descritti nel presente documento, espandere EPC isolato fino a quando sono quasi confluenti in 3 palloni delle cellule T-75 di media cultura in EPC in un incubatore umidificato a 37 ° C, 5% di CO 2. 2. Sollecitazione di taglio di calcolo Si consiglia di questi calcoli vengono eseguiti prima della fabbricazione della camera e il canale di avere una conoscenza approfondita delle condizioni che possono essere raggiunti. Calcolare la portata del perfusato nel circuito basato sul taglio desiderato sollecitazioni da applicare alle celle secondo l'equazione 1 1, dove Q è la portata desiderata, τ è il bersaglio ssentire lo stress agisce tangenzialmente sulle cellule, w è la larghezza della camera di flusso, h è l'altezza della camera di flusso, e μ è la viscosità del perfusato (media portata). Un valore tipico di viscosità (μ) per il mezzo utilizzato è di 0,9 cP (0,009 g cm -1 s -1). Si noti che la viscosità può anche essere sollevato usando ad elevato peso molecolare destrano, se lo si desidera 7. Un valore tipico di stress obiettivo di taglio (τ) utilizzato è di 15 dyne / cm 2, (tipica sollecitazione di taglio delle arterie) o 100 dyne / cm 2, se sovrafisiologiche sforzo di taglio è voluta. La nostra camera è tipicamente una larghezza (w) di 1,9 cm e altezza (h) nel range di 166-267 micron. 3. Camera di flusso di produzione Tagliare le piastre superiore e inferiore del secolocamera e in lega di alluminio 6061 magazzino rettangolare con dimensione superiore di 7 x 2 "dimensioni e inferiore del 7 x 2 x 0,25" x 0,5. Recess la piastra superiore nella parte centrale a 0,125 "profondo, lasciando 0,950" per fine di 1,375 "di larghezza x 0,3125" serbatoio del liquido profondo. Drill 1 / 16 "di larghezza x 0,625" slot lungo dalla parte inferiore per penetrare al serbatoio sull'afflusso e termina deflusso. Alla fine di ogni piastra superiore, praticare un centrale 10/32 "tracce per pollice (TPI) foro per polipropilene 1 / 8" portagomma per penetrare nel serbatoio del liquido. Al fine di afflusso, creare un plug lato con 10/32 "TPI attraverso il foro per il polipropilene 1 / 8" portagomma. Cono nella parte inferiore dalla parte superiore l'afflusso del fluido alla finestra di visualizzazione in vetro a 0,518 gradi per una adeguata miscelazione di liquido. Tagliare lastra di vetro di una finestra nella piastra inferiore in linea con finestra di visualizzazione superiore. Utilizzando cemento acquario, colla un vetrino nella camera. Lasciare cura per almeno 24 ore.Assicurarsi che la finestra di visualizzazione è incassato in modo che un 75 x 25 x 1 vetrino da microscopio mm vetro siederà a filo nella camera. Creare un incavo per un o-ring di tutto il lato inferiore delle piastre superiore e inferiore in modo che siano distanziate da 0.02 ". Inserire la gomma O-ring. Trapano 10 corrispondenti 8 / 32 "buchi TPI in camere superiore e inferiore per l'utilizzo con 8 / 32" viti a testa piatta. 4. Assemblaggio di flusso circuito Assemblare l'intero circuito primo flusso, quindi procedere con la sua sterilizzazione. Collegare un "segmento di tubo difficile un'estremità del attenuatore delle pulsazioni (via 1 / 8" 36 connessione). All'altra estremità, collegare un 18 "segmento di tubo morbido. Posizionare un 1 / 8 "adattatore maschio luer alla fine dei 18" sezione di tubo morbido, di cui al punto 4.2. Collegare il luer maschio ad un 1 / 8 "adattatore femmina luer. Collegare il luer femmina ad un nuovo 18" tubi nei soft. Praticare tre fori in un bicchiere di vetro tappo 250 ml al fine di adattare tubi. Ionsert da 1,5 "segmento di tubo morbido (come presa d'aria) in una buca e l'estremità libera del tubo hard e soft con gli altri 2 fori nel tappo nella bottiglia di 250 ml in vetro (come riserva) (Fig. 2). Assicurarsi che il tubo dura raggiunge il fondo del serbatoio (come tubi di deflusso dal serbatoio). Sterilizzare le parti sopraindicate in autoclave a vapore a 121 ° C per 60 min. Inoltre autoclave una camera completa di flusso, 3 x 2 "segmenti di tubo morbido, 1 maschio e 1 femmina 1 / 8" adattatore luer, 4 x ½ "e 6 x 5 / 16" 8-32 viti a testa piatta, 1 paio di pinzette , un 75 x 25 x 1 vetrino mm (o altro materiale desiderato della superficie delle cellule), e 2 teli chirurgici. Luogo teli sterili in cappa a flusso laminare. Posizionare il circuito di flusso, camera di flusso, 4 x 4-way rubinetti, 1 x 1-way rubinetto, e tutte le parti sterilizzato dal punto 4,5 su questo campo sterile. Ora usare guanti sterili per collegare due 4-way rubinetti. Tappi posto sulle porte campione aperto. </li> Staccare gli adattatori maschio e femmina luer collegare i due segmenti tubo morbido del circuito di flusso e inserire i rubinetti collegati (Fig. 3). Collegare il tubo morbido inserito nel serbatoio di una siringa da 30 ml e togliere il pistone della siringa. Riempire la bottiglia con 125 ml di EPC media (Fig. 4). Collocare un filtro sterile nella siringa la presa d'aria (Fig. 4). Spostare il circuito di flusso in un incubatore umidificato a 37 ° C, 5% di CO 2. Bloccare il tubo fisso in testa della pompa rullo indicato per l'uso con questo tipo di tubo (Fig. 5). Assicurarsi che il tubo non si sovrappone con le tracce pompa il rullo di montaggio. Segna il tubo dove esce la testa della pompa su entrambi i lati con un pennarello. Assicurarsi che tutti i rubinetti sono chiusi verso i porti del campione e si aprono lungo il circuito di flusso. Avviare la pompa. Verificare la direzione del flusso. Il perfusato deve muoversi from il serbatoio di vetro attraverso il tubo rigido nel attenuatore delle pulsazioni. 5. EPC fluorescenti etichettatura Mentre il flusso del circuito riscalda a 37 ° C, preparare le cellule per la semina sul vetrino. Si noti che l'etichettatura fluorescente è necessaria se le cellule devono essere visualizzate su materiali opachi, ad esempio, titanio (Ti). Creare un 1 soluzione madre mM di Cell Tracker Orange (CTO) diluendo 50 mcg CTO polvere con 90 ml di dimetilsolfossido (DMSO). Assicuratevi di proteggere questa miscela da esposizione alla luce (spegnere la luce durante il lavoro sotto cappa a flusso). Creare una soluzione 2 mM di lavoro di CTO diluendo 36 ml di soluzione madre CTO in 18 ml di siero senza MCDB-131 di media. Sciacquare EPC in 3 palloni vicino cellule confluenti T-75 DPBS cultura con 10 ml (senza Ca e Mg). Aggiungere 6 ml di soluzione 2 mM CTO di lavoro ad ogni pallone. Incubare per 15 min a 37 ° C. Risciacquare ogni pallone x 2 con 10 DPBS ml (senza Ca e Mg). <li> Aggiungere 4 ml di tripsina ad ogni pallone. Incubare a 37 ° C per 3 min. Neutralizzare con 8 ml di soluzione di neutralizzazione tripsina. Lavare per centrifugazione x 5 min a 600 g e risospendere in 5 ml di terreno EPC. 6. Semina di cellule di scivolare prima di flusso di assemblaggio camera Una diapositiva fatta di vetro, titanio, o altro materiale può essere utilizzato, e la superficie di scorrimento può essere modificata con polimero spin coating o l'aggiunta di uno strato di metallo. Mettere il vetrino in una sterile rettangolare quattro camere nave coltura cellulare (o tessuto utilizzare fiasco cultura scivolo superficie di polistirolo se si desidera). Contare le celle e semi di 1,5 x 10 6 cellule sul vetrino in 5 ml di EPC medio x 6 ore se uno strato di cellule confluenti è desiderato all'inizio del flusso (Fig. 11A). Al fine di testare la diffusione e l'adesione delle cellule sotto fluido shear stress, permette 3 x 10 6 cellule di aderire solo per 15 minuti prima dell'inizio del flusso (quick-semina) ( <strong> Fig. 11B). 7. Flusso di camera di montaggio Utilizzando guanti sterili, collegare 2 "segmento morbido tubo ad un 1 / 8" adattatore femmina luer. Collegare un altro 2 "segmento morbido tubo ad un 1 / 8" adattatore maschio luer. Collegare il 2 "tubo morbido con adattatore femmina luer alla porta afflusso. Attaccare il 2" tubo morbido con maschio luer alla porta deflusso. Collegare 4-way a due rubinetti di questi adattatori luer. Collegare il restante 2 "pezzo morbido tubo al connettore della porta lato venuta fuori il gorgogliatore e allegare un 1-via rubinetto (Fig. 6). Usando le pinzette sterili, rimuovere la cellula testa di serie diapositiva dal recipiente di coltura cellulare (o se si usa un pallone di diapositive, togliere il pallone sulla slitta) e posizionarlo nella cavità sul fondo piatto della camera di flusso. Assicurarsi che la diapositiva è posta con la cellula-seminato verso l'alto. Pipettare 10 ml di medium caldo EPC sulla diapositiva. Lasciare che il mezzo per coprire la diapositiva e camera di flusso, but non versare il medium nel corso degli O-ring sul fondo piatto. Posizionare la piastra superiore della camera di flusso sulla piastra di fondo, allineando i fori delle viti. Fare attenzione a non introdurre bolle d'aria nella camera durante questa fase, mantenendo le due piastre parallele. Piastre di vite insieme (un automatico a batteria velocità cacciavite questo processo). Rimuovere le bolle d'aria dalla trappola afflusso bolle aprendo il 1-way rubinetto collegato al flusso porta sul lato bolla trappola e lavare delicatamente il tubo di afflusso medio con EPC usando una siringa da 10 ml. Poi chiudere questo rubinetto e tappo (Fig. 7). Ora rimuovere le bolle d'aria dal canale camera aprendo la porta di uscita a 4 vie rubinetto e delicatamente flussaggio EPC attraverso la camera di flusso, sempre usando una siringa da 10 ml. Se bolle di grandi dimensioni rimangono, sollevare l'estremità deflusso della camera ad un angolo di 45 ° (Fig. 8). Cap di tutte le connessioni a 4 vie rubinetto e chiudidi dosso. Spostare la camera di flusso nell'incubatore con il circuito di flusso montato (Fig. 9). Mettere in pausa la pompa del circuito di flusso. Chiudere i rubinetti del flusso circuito nella direzione del flusso per evitare perdite e per mantenere l'interno della camera sterile. Trasporto camera di flusso dalla cappa a flusso al circuito di flusso. Collegare la camera di flusso al circuito di flusso. Aprire i rubinetti in direzione del flusso. Riprendere il flusso della pompa. Assicurarsi che il perfusato scorre nella direzione corretta. Regolare la portata per lo sforzo di taglio desiderato. Durante l'esperimento di flusso, la camera di flusso può essere rimosso dal circuito per l'immagine della luce o cellule tramite microscopia a fluorescenza. Per fare ciò, scollegare la camera di flusso dal circuito di flusso al rubinetto-rubinetto connessioni. Per mantenere la sterilità della camera, chiudere i rubinetti del flusso del circuito e rubinetti camera di flusso nella direzione del flusso e cappuccio tutti i rubinetti prima di rimuovere il circuito di flussodal termostato (Fig. 9). 8. Perfusato raccolta dei campioni Per una facile raccolta di campioni per l'analisi perfusato, (ad esempio la sintesi di ossido nitrico), prima pausa la pompa. Chiudere il rubinetto situato più vicino al attenuatore delle pulsazioni. Togliere il tappo di protezione ed inserire una siringa di piccole dimensioni, ad esempio, siringa da 3 ml, nella porta campione. Mantenere tappo e assicurarsi che non diventerà contaminata mettendolo a testa in giù. Chiudere il rubinetto nella direzione della camera di portata, mantenendo la porta campione e circuito in direzione della attenuatore delle pulsazioni aperto. Disegna quantità desiderata di campione, esempio 150 microlitri, dal circuito. Chiudere il rubinetto verso il porto campione prima di rimuovere la siringa. Conservare il campione perfusato in un flaconcino etichettati e congelare a – 80 ° C (per la determinazione ossido nitrico in un punto secondo momento). Recap della porta campione e assicurarsi che tutti i rubinetti sono aperti prima di iniziare flusso. 9. Rappresentante risultati Utilizzando il nostro metodo rapido di semi, derivati ​​dal sangue umano le cellule progenitrici endoteliali possono essere seminati su vetrini in titanio per 15 minuti e di aderire con fisiologica (arteriosa) forze di taglio di 15 dyne / cm 2. Come mostrato in Figura 10, EPC diffusione sotto l'influsso di flusso da 210 ± 11,4 micron 2, subito dopo la semina, a 657 ± 39,1 micron 2 dopo 3 ore, e fino a 1152 ± 55,3 micron 2 dopo 24 ore di fluido sforzo di taglio di 15 dyne / cm 2 (differenza tra i due gruppi è statisticamente significativa con p <0,0001, 1-way ANOVA). Parallelamente all'aumento della superficie delle cellule, che possono essere esposte attraverso la camera trasparente con microscopio a luce o fluorescenti, la rotondità calcolata secondo l'equazione 2 6 / Files/ftp_upload/3349/3349eq2.jpg "/> è diminuito da 878 x 10 -3 ± 5.9 x 10 -3, subito dopo la semina, a 671 x 10 -3 ± 19,2 x 10 -3 dopo 3 ore, e di 526 x 10 -3 ± 19,2 x 10 -3 dopo 48 ore della stessa esposizione sforzo di taglio fluido (differenza tra i gruppi è di nuovo statisticamente significativa con p <0,0001, 1-way ANOVA). Figura 11D dimostra che EPC allineare e orientare nella direzione del flusso dopo 48 ore di liquido sforzo di taglio a 15 dyne / cm 2 rispetto al loro orientamento casuale, dopo un periodo di semina statico di 6 ore, mostrata in Figura 11A. Il nostro metodo permette anche di ottenere campioni del perfusato a tempi predeterminati per l'/ o l'analisi e la quantificazione dei metaboliti delle cellule secreto. Come un esempio rappresentativo che raffigurano la produzionezione di nitriti (NO 2 -) durante un esperimento di flusso 48 ore con EPC suina in Figura 12. Abbiamo misurato direttamente il prodotto primario dell'ossidazione di ossido nitrico (NO) come marker surrogato di NO nei campioni raccolti medio dal circuito del flusso nei punti di tempi diversi da 12,0 nmol a 6 ore, 13.1 nmol a 12 ore, 16.3 nmol a 24 ore, e il 24,6 nmol dopo 48 ore per 1 x 10 6 celle a 15 dyne / cm 2 6. Figura 1. Schematica che mostra una panoramica del circuito di assemblaggio di flusso e flusso di esperimento. (A) circuito di assemblaggio di portata senza la camera di flusso. Vi sono incluse nel serbatoio, attenuatore di pulsazioni, tubi rigidi, tubo morbido, 4-way rubinetti e collegato adattatori luer, così come il filtro dell'aria. (B) Collegamento della camera di flusso attraverso il segmento di tubo rigido alla testa della pompa di flusso. (C) In serimento della CBE testa di serie scivolare la piastra inferiore della camera di flusso (D). Completa il montaggio del circuito flusso con la camera di flusso. Figura 2. Circuito flusso Completamente assemblato per la sterilizzazione. Figura 3. Circuito flusso assemblato dopo la sterilizzazione con rubinetti incluso. Figura 4. Riempire il serbatoio di vetro con 125 ml di terreno EPC. Figura 5. Flusso circuito bloccato nella testa della pompa flusso prima dell'inserimento del flusso da camera. jpg "/> Figura 6. Top Assieme piastra da camera. Figura 7. Flushing il gorgogliatore di medio EPC per rimuovere le bolle afflusso dal lato della camera. Figura 8. Flushing la camera di medio EPC per rimuovere le bolle dalla diapositiva e lato uscita della camera. Figura 9. Completamente assemblato circuito di flusso con camera di flusso inserito nel corso di un esperimento di portata. Figura 10. Zona EPC (in micron 2) aumenta nel corso del tempo l'esperimento di flusso. files/ftp_upload/3349/3349fig11.jpg "/> Figura 11. (A) immagine al microscopio di Luce HUCB EPC seminate su un vetrino fibronectina vetro rivestito x 6 ore prima di scorrere a 100 ingrandimenti. (B) HUCB EPC etichettati con CTO e rapido seminate su un vetrino Ti x 15 minuti prima di fluire, visualizzata con la microscopia a fluorescenza a 100 ingrandimenti. (C) La stessa diapositiva Ti con EPC HUCB come sotto (B), dopo 3 ore di flusso a 100 dyne / cm 2 e ripreso attraverso la camera trasparente a 100 ingrandimenti. Notare l'orientamento diffusione di cellule, ma comunque casuale dopo 3 ore di flusso. (D) La stessa diapositiva Ti, ora dopo 48 ore di esposizione del flusso a 100 ingrandimenti. EPC sono etichettati con CTO e nuclei delle cellule sono colorate con Hoechst colorante (blu) dopo che il flusso. Si noti l'allineamento delle cellule nella direzione del flusso. (E) EPC suina per il confronto su Ti dopo 48 ore di flusso e 15 dyne / cm <sup> 2 di esposizione sforzo di taglio. I bordi delle celle sono state colorate con anticorpi anti-macchia PECAM (verde) e nuclei con Sytox Acid Orange nucleici macchia. Si noti l'allineamento delle celle nella direzione del flusso. Grafico figura 12. Illustra la produzione di NO di EPC suina nelle 48 ore di flusso. Un prodotto di ossidazione primario di NO, nitriti (NO 2 -), è stata misurata come un marker surrogato di NO da campioni di media raccolti in diversi momenti durante il flusso. Figura 13. La camera di flusso è realizzato in lega di alluminio 6061 magazzino rettangolare, con la sezione superiore (A) è 0,5 "x 2" x 7 "e la sezione inferiore (B) 0,25" x 2 "x 7" in dimensione. Il piano èpiallate sul lato inferiore della O-ring superficie di contatto a 0,45 "al fine di assicurare la planarità per la sigillatura. La parte superiore è incassato nella sua parte centrale a 0,125", che lascia 0.95 "al fine di una 0,3125" x 1,375 "serbatoio del liquido. Il serbatoio parte superiore è filettato 3/8-24 TPI e 0,25 "in profondità per ricevere le spine filettate in acciaio inox. Slot di misura 1 / 16 "x 0,625" sono stati lavorati nella parte inferiore che penetrano al serbatoio. La spina lato afflusso ha un 10/32 "foro passante per un polipropilene 1 / 8" portagomma da collegare al rubinetto. Ogni unità ha un fine in posizione centrale filettato 10/32 TPI da 0,25 "per una porzione profonda polipropilene 1 / 8" portagomma alla fine 0,45 "x 2". Le estremità utilizzare un 0,07 "buco dal fondo di fili di penetrare attraverso il serbatoio. La parte inferiore della parte superiore ha una superficie conica 0,6875" di larghezza, 0,518 gradi dal centro di uno slot LH per una distanza di 1,460 ". Questo cono fonde ad una zona pianeggiante 0,6875 "x larga 0,0118" in profondità e 0,590 "dalla fine del vetros (o altra superficie, far scorrere in titanio per esempio) recesso. L'appartamento deve essere a filo con il vetro (o altra superficie, far scorrere in titanio ad esempio) una volta che la diapositiva è installato. Il cono e piatto sono lucidati. La superficie del vetrino è 0,0118 "incassato dalla superficie inferiore. La 0,0118" nicchia continua a slot serbatoio sul lato destro. Un O-ring è incassato interamente intorno slot e far scorrere lasciando 0.020 "della superficie originale tra l'O-ring groove e diapositive. La parte superiore e le unità inferiori sono forati per una decina di buche. La parte superiore ha fori passanti per 8 / 32 TPI svasata piana viti a testa. La sezione inferiore ha fori posti corrispondenza dei fori in alto e sono filettati 8 / 32 TPI. L'unità di fondo ha un chiaro scorrono a filo vetro incasso finestra con la sua superficie si trova sopra il vetrino superficie cellulare (o scivolare in titanio). L'unità ha un O-ring scanalatura che comprende slot nell'unità superiore con larghezza di lasciare 0.04 "della superficie originaria tra il vetrino inferiore e quello interno O-ring scanalatura. L'O-rings sono silicone rosso AS568A, Dash Numero 044 per la sezione superiore e 046 per la sezione in basso.