במקביל, צלחת תזרים לשכת ואת מעגל זרימה רציפה להערכת ובתאים אנדותל תחת מתח זרימה למינרית שאר

1. אבי האנדותל תא הבידוד לפני כל איסוף של דם אנושי הפריפריה, להגיש פרוטוקול המחקר שלך לדירקטוריון סקירה מוסדיים שלך (IRB), לאחר אישורה, יש לקבל את התורמים בהתנדבות "הסכמה מדעת (אוסף דם היקפיים ובידוד EPC אושרו על ידי IRB אוניברסיטת דיוק ו הוא תוך ציות מלא לדרישות הרגולציה בארה"ב הקשור להגנה על המשתתפים במחקר האדם). כאשר עובדים עם בעלי חיים הנגזרות EPCs, יש פרוטוקול המחקר אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים שלך השתמש הוועדה (IACUC). כל הניסויים שלנו חזירי אושרו על ידי אוניברסיטת דיוק IACUC ו נערכו בהתאם לסטנדרטים הגבוהים ביותר של טיפול הומני. עבור בידוד של ובתאים אנדותל, לאסוף 50 מ"ל של דם היקפיים באמצעות טכניקה phlebotomy תקן מתורם מתנדב הסכים לתוך שקיות איסוף דם מלא citrat נוגד הקרישהדואר פוספט דקסטרוז ו לדלל את התמיסה 01:01 עם פתרון שנאגרו של האנק מלח (ללא CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4) שכבת על כמויות שוות של Histopaque כדי ליצור שכבות מוגדרות היטב. צנטריפוגה (30 דקות, 740 גרם, הגדרת לשבור נמוך) לאסוף את התא mononuclear (MNC) (באפי מעיל) השכבה. Resuspend ולשטוף MNCs x 3 עם פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוחים (DPBS) עם סרום 10% שור עוברית (FBS) x 10 דקות, 515 גרם, לפני ציפוי לשתי -12 גם צלחות בינוני מלא צמיחה EPC (MCDB-131 בינוני עם 5 מ"ל של 200 מ"מ L-גלוטמין, 10% FBS ו EGM-2 SingleQuots) בשעה 37 ° C, 5% CO 2. לאט לאט לשנות בינוני כל 24 שעות במשך 7 הימים הראשונים, ולאחר מכן בכל יום אחר. מושבות EPC ניתן לזהות לאחר תקופה ממוצעת של 14 ימים על בסיס מורפולוגיה המרוצף שלהם. לאחר EPCs ב ¼ תרבות לכסות שטח של 12-היטב את פני השטח, להרחיב תאים לאשר זהות EPC עם cytometry זרימה על ידי בדיקת נוכחות סמנים פני השטחCD31 והיעדר CD14, CD45 כפי שתואר לעיל 6. מבחני אחרים שעלולים להתבצע כוללים מורפולוגיה תא וסימון עם DiI-AC-LDL. על הניסויים המתוארים כאן, להרחיב EPCs מבודד עד שהם ומחוברות כמעט 3 T-75 תרבות צלוחיות תא בינוני EPC ב חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. 2. הלחץ שאר החישוב אנו ממליצים כי חישובים אלה מבוצעים לפני בייצור קאמרית ערוץ יש הבנה מעמיקה של התנאים שניתן להשיג. חשב את קצב הזרימה של perfusate במעגל שלך מבוסס על גזירה הרצוי מדגיש שיש להחיל את התאים לפי משוואה 1 1, איפה ש הוא שיעור זרימת הרצוי, τ הוא היעד שללשמוע הלחץ משחק בעקיפין על התאים, W הוא רוחב של תא הזרימה, h הוא הגובה של החדר הזרימה, μ הוא צמיגות של perfusate (בינוני זרימה). ערך טיפוסי של צמיגות (μ) עבור שימוש בינוני הוא 0.9 CP (0.009 גרם ס"מ -1 s -1). שים לב צמיגות ניתן גם העלה באמצעות משקל גבוה dextran מולקולרית, אם רוצים כל כך 7. ערך טיפוסי של מתח גזירה היעד (τ) היא להשתמש dynes 15 / 2 ס"מ, (גזירה אופייני מתח העורקים) או 100 dynes / 2 ס"מ, אם העל פיזיולוגיים מתח גזירה היא הרצויה. החדר שלנו בדרך כלל יש רוחב (w) של 1.9 ס"מ וגובה (ח) בטווח של 166-267 מיקרומטר. 3. תא ייצור תזרים חותכים את צלחות העליון והתחתון של התא דואר ממלאי סגסוגת אלומיניום 6061 מלבני עם הממד העליון של 7 x 2 "ממדים והתחתון של 7 x 2 x 0.25" x 0.5. הפסקה את הצלחת העליונה בחלק מרכז 0.125 "עמוק, עוזב 0.950" לכל סוף 1.375 עבור "רחב x 0.3125" מאגר הנוזלים עמוק. מקדחה 1 / 16 "רחב x 0.625" חריצי ארוכה התחתון על מנת לחדור אל המאגר על יבוא ומסתיים יצוא. בסוף כל צלחת העליון, לקדוח במיקום מרכזי 10/32 "מסלולים לאינץ' (TPI) חור עבור פוליפרופילן 1 / 8" עקיצה צינור לחדור למאגר נוזלים. בצד יבוא, ליצור תקע לצד 10/32 "TPI דרך החור של פוליפרופילן 1 / 8" עקיצה צינור. שפיד התחתון העליון מזרם הנוזל אל חלון זכוכית לצפייה ב 0.518 מעלות נאות ערבוב של נוזל. גזור חלון שקופיות זכוכית לתוך צלחת תחתית בקו אחד עם חלון לצפייה העליון. באמצעות מלט אקווריום, דבק שקופיות הזכוכית לתוך החדר. אפשר לרפא לפחות 24 שעות.ודא כי חלון הצפייה הפסקה כך 75 x 25 מ"מ x 1 מיקרוסקופ שקופיות זכוכית אשב סומק בחדר. צור ההפסקה עבור טבעת-O סביב החלק התחתון של צלחות העליון והתחתון כאלה שהם במרווחים זה מזה על ידי 0.02 ". הכנס את O-טבעות גומי. מקדחה 10 התאמת 8 / 32 "חורים TPI בתאי העליון והתחתון לשימוש עם 8 / 32" ברגי ראש שטוח. 4. מעגל הרכבה Flow להרכיב את מעגל זרימה כולו תחילה, ואחר כך להמשיך עם העיקור שלה. צרף "קטע של צינורות קשה בקצה אחד של dampener הדופק (דרך 1 / 8" 36 קשר). כדי לסיים את האחר, לצרף קטע 18 "של צינורות רך. מניחים 1 / 8 "מתאם luer זכר בסוף 18" קטע צינור רך, שהוזכר בשלב 4.2. חבר את luer זכר ל 1 / 8 "מתאם luer הנשי. צרף את luer נקבה חדשה 18" צינורות קטע רך. מקדחה שלושה חורים לתוך כובע 250 מ"ל כוס זכוכית על מנת להתאים צינורות. אניnsert 1.5 ", קטע של צינור רך (כמו פתח אוורור) לתוך חור אחד מסתיים ללא צינור רך וקשה דרך 2 חורים אחרים המכסה לבקבוק 250 מ"ל זכוכית (כמאגר) (איור 2). ודא צינורות קשה מגיע התחתון של המאגר (כמו צינורות יצוא מן המאגר). לעקר את החלקים הנ"ל על ידי מעוקר קיטור על 121 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. בנוסף החיטוי קאמרי זרימה מלאה, 3 x 2 "מקטעים של צינור רך, 1 זכר נקבה 1 1 / 8" מתאם luer, 4 x ½ "ו 6 x 5 / 16" 8-32 ברגים ראש שטוח, 1 פינצטה אחד 75 x 25 מ"מ x 1 כוס שקופית (או משטח אחר הרצוי חומר התא), ו 2 מגבות כירורגית. המקום המגבות זרימה למינרית לתוך מכסה המנוע. מניחים את מעגל זרימה, חדר זרימה, 4 x 4-way והברזים למיניהם, 1 x 1-דרך שסתום, וכל החלקים מעוקרים משלב 4.5 למגרש הזה סטרילי. עכשיו להשתמש בכפפות סטריליות לחבר שני 4-way והברזים למיניהם. המקום כמוסות על יציאות מדגם פתוח. </li> ניתוק מתאמי luer זכר ונקבה מצרף את שני פלחי צינורות הרכה של מעגל זרימת והכנס את והברזים למיניהם מחוברים (איור 3). חבר את צינור רך מוכנס לתוך המאגר כדי מזרק 30 מ"ל ולהסיר את הבוכנה במזרק. מלאו את בקבוק 125 מ"ל של EPC בינוני (איור 4). מקום מסנן מזרק סטרילי לתוך פתח האוורור (איור 4). הזז את המעגל לזרום לתוך חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. קלאמפ בצינור הקשיח לתוך הראש רולר המשאבה המצוין לשימוש עם סוג זה של צינור (איור 5). ודא כי הצינור אינו חופף עם המשאבה פסי גלילה גובר. סמן את צינורות איפה זה יוצא ראש משאבה מכל צד עם עט סימון. ודא שכל והברזים למיניהם סגורים לכיוון היציאות המדגם פתוח לאורך מעגל הזרימה. הפעל את המשאבה. בדוק את כיוון הזרימה. Perfusate צריך להזיז frאום המאגר זכוכית דרך צינור קשיח לתוך dampener את הדופק. 5. EPC ניאון תיוג בעוד מעגל זרימה מחמם עד 37 מעלות, להכין את התאים עבור זריעת לשקופית. שים לב תיוג פלורסנט נדרש אם התאים להיות דמיינו על חומרים אטומים, כגון טיטניום (TI). יצירת מלאי 1 mM פתרון של תא כתום Tracker (CTO) על ידי דילול 50 מיקרוגרם CTO אבקה עם 90 μl של sulfoxide דימתיל (DMSO). הקפד מגן זו תערובת של חשיפה לאור (לכבות את האור בזמן שעבד מתחת למכסה המנוע לזרום). יצירת 2 מיקרומטר פתרון העבודה של ה-CTO על ידי דילול של 36 μl פתרון מניות CTO לתוך 18 מ"ל של מדיום MCDB-131 בסרום חינם. יש לשטוף EPCs ב 3 ליד ומחוברות T-75 תרבות צלוחיות עם תא DPBS 10 מ"ל (ללא Ca או Mg). הוסף 6 מ"ל של פתרון ה-CTO 2 מיקרומטר פועלים כל בקבוק. דגירה של 15 דקות בשעה 37 ° C. יש לשטוף את כל הבקבוק x 2 עם 10 מ"ל DPBS (ללא Ca או Mg). <li> הוסף 4 מ"ל של טריפסין על כל בקבוק. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. לנטרל עם 8 מ"ל של פתרון נטרול טריפסין. שטפי על ידי x 5 דקות צנטריפוגה ב 600g ו resuspend ב 5 מ"ל של מדיום EPC. 6. תא זריעה של השקופית לפני זרימת הרכבה קאמרית שקופית מזכוכית, טיטניום, או חומר אחר יכול לשמש, וכן להחליק את פני השטח ניתן לשנות על ידי ציפוי ספין עם פולימר או הוספת שכבה של מתכת. מניחים את השקופית לתוך כלי סטרילי מלבני ארבע תא תא התרבות (או רקמה להשתמש תרבות שקופיות בקבוק אם משטח קלקר הוא הרצוי). ספירת תאים וזרעי 1.5 x 10 6 תאים לשקופית ב 5 מ"ל של שעה EPC בינוני 6 x אם שכבת תאים ומחוברות הוא הרצוי על תחילתו של זרם (איור 11 א). על מנת לבחון תא הפצת הידבקות תחת לחץ גזירה נוזל, מאפשרים 3 x 10 6 תאים לדבוק רק 15 דקות לפני תחילתו של זרם (זריעה מהירה) ( <strong> איור. 11 ב). 7. תא זרימה הרכבה שימוש בכפפות סטריליות, חבר את 2 "קטע צינור רך 1 / 8" מתאם luer הנשי. חבר אחר 2 "קטע צינור רך 1 / 8" מתאם luer זכר. חבר את 2 "צינור רך עם מתאם luer נקבה לנמל יבוא. צרף את 2" צינור רך עם luer זכר ליציאת יצוא. צרף 4-way והברזים למיניהם הן אלה מתאמים luer. חבר את 2 הנותרים "חתיכת צינור רך למחבר בצד יציאת הקרובים את מלכודת בועה לצרף שסתום 1-הדרך (איור 6). בעזרת פינצטה סטרילי, להסיר את השקופית תא זרע מספינת תא התרבות (או אם באמצעות בקבוק שקופיות, להסיר את הבקבוק בשקופית) ולמקם אותו לתוך ההפסקה על הצלחת התחתונה של החדר הזרימה. ודא כי את השקופית ממוקם בצד התא seeded פונה כלפי מעלה. Pipet 10 מ"ל של מדיום EPC חם לשקופית. אפשר המדיום כדי לכסות את שקופיות תא זרימה, בUT לא לשפוך את המדיום מעל טבעת-O על הצלחת התחתונה. מניחים את הצלחת העליונה של החדר תזרים לצלחת התחתונה, ליישר את חורי הברגים. הקפידו לא להכניס בועות אוויר לתוך תא במהלך שלב זה על ידי שמירה על שני לוחות מקבילים. בורג צלחות יחד (אוטומטי המופעל באמצעות סוללה נטענת מהירויות מברג את התהליך הזה). הסר בועות אוויר ממלכודת בועה יבוא על ידי פתיחת שסתום 1-בדרך המצורפת הנמל יבוא בצד מלכודת בועה בעדינות ולשטוף את צינורות יבוא עם המדיום EPC באמצעות מזרק 10 מ"ל. ואז לסגור את הברז הזה ואת כובע זה (איור 7). עכשיו להסיר בועות אוויר מערוץ קאמרית ידי פתיחת נמל יצוא 4-way שסתום ועל ידי שטיפה בעדינות בינוני EPC דרך תא הזרימה, שוב באמצעות מזרק 10 מ"ל. אם הבועות גדולות להישאר, להעלות סוף יצוא של החדר עד זווית של ° 45 (איור 8). שווי כל 4-way חיבורי שסתום ולסגוראותם. הזז את תא לזרום לתוך החממה עם מעגל זרימת התאספו (איור 9). השהה את המשאבה במעגל הזרימה. סגור את המעגל והברזים למיניהם זרימה לכיוון הזרימה כדי למנוע דליפה ולשמור את החלק הפנימי של חדר סטרילי. התחבורה הקאמרית לזרום למכסה המנוע לזרום במעגל זרם. חבר את תא לזרום במעגל זרם. פתח את והברזים למיניהם לכיוון הזרימה. קורות חיים המשאבה תזרים. ודא perfusate זורם בכיוון הנכון. התאם את קצב הזרימה ללחץ גזירה הרצוי. במהלך הניסוי זרימה, חדר זרימת ניתן להסיר מן המעגל לתמונה תאים באמצעות אור או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לעשות זאת, נתק את תא לזרום במעגל זרם בכל החיבורים שסתום, שסתום. כדי לשמור על סטריליות של החדר, לסגור את המעגל זרימת והברזים למיניהם קאמרית והברזים למיניהם לזרום לכיוון הזרימה כובע כל והברזים למיניהם לפני הסרת מעגל זרימהמן האינקובטור (איור 9). 8. Perfusate אוסף מדגם עבור איסוף קל של דגימות perfusate לניתוח, (למשל תחמוצת החנקן סינתזה), הפסקה הראשונה של המשאבה. סגור את שסתום הממוקם קרוב dampener את הדופק. הסר את כיסוי המגן שלו להכניס מזרק גודל קטן, למשל מזרק 3 מ"ל, ליציאת המדגם. שמרו כובע ולוודא שהיא לא תהפוך מזוהמים על ידי הצבת אותו הפוך. סגור את שסתום לכיוון החדר זרימה, שמירה על יציאת מדגם במעגל בכיוון של dampener הדופק פתוח. צייר כמות הרצוי של המדגם, למשל 150 μl, מן המעגל. סגור את שסתום לכיוון הנמל מדגם לפני הסרת מזרק. חנות המדגם perfusate בבקבוקון שכותרתה ולהקפיא ב – 80 ° C (להגדרה תחמוצת החנקן בשלב מאוחר יותר). Recap הנמל מדגם ולהבטיח כי כל והברזים למיניהם פתוחים לפני תחילת הזרימה. 9. נציג תוצאות באמצעות שיטה זרע מהיר שלנו, אדם דם הנגזרות ובתאים אנדותל ניתן זורעים על גבי שקופיות טיטניום במשך 15 דקות ו לדבוק תחת (עורקים) כוחות פיזיולוגיים גזירה של 15 dynes / 2 ס"מ. כפי שניתן לראות בתרשים 10, EPCs להפיץ תחת השפעת תזרים מ 210 ± 11.4 מיקרומטר 2, מיד לאחר הזריעה, כדי 657 ± 39.1 מיקרומטר 2 אחרי 3 שעות, עד 1152 ± 55.3 מיקרומטר 2 לאחר 24 שעות של מתח גזירה נוזל של 15 dynes / 2 ס"מ (ההבדל בין הקבוצות הוא מובהק סטטיסטית עם p <0.0001, 1-way ANOVA). במקביל לגידול שטח התא, אשר ניתן הדמיה באמצעות תא שקוף עם מיקרוסקופ או אור או פלורסנט, עגלגלות המחושב לפי משוואה 2 6 / Files/ftp_upload/3349/3349eq2.jpg "/> ירד מ 878 x 10 -3 ± 5.9 x 10 -3, מיד לאחר זריעה, אל 671 x 10 -3 ± 19.2 x 10 -3 אחרי 3 שעות, עד 526 x 10 -3 ± 19.2 x 10 -3 לאחר 48 שעות החשיפה של נוזל אותו גזירה מתח (ההבדל בין הקבוצות הוא שוב מובהקות סטטיסטית עם p <0.0001, 1-דרך ANOVA). איור 11D ממחיש EPCs כי ליישר לכוון לכיוון הזרימה לאחר 48 שעות של מתח גזירה נוזל dynes 15 / 2 ס"מ לעומת אוריינטציה אקראי שלהם לאחר תקופה זריעת סטטי של 6 שעות, שמוצג באיור 11 א. השיטה שלנו מאפשרת גם קבלת דגימות של perfusate בנקודות זמן קבועות מראש עבור ניתוח ו / או כימות של מטבוליטים התא מופרשים. כדוגמה נציג אנו מתארים את production של הניטריט (NO 2 -) במהלך הניסוי זרימה 48 שעות עם EPCs חזירי באיור 12. אנו נמדדים ישירות את המוצר הזה חמצון העיקרי של תחמוצת החנקן (NO) כסמן פונדקאית עבור NO בדגימות שנאספו בינוני מעגל זרימה בנקודות זמן שונות כדי להיות 12.0 nmol ב 6 שעות, 13.1 nmol ב 12 שעות, 16.3 nmol ב 24 שעות, 24.6 nmol לאחר 48 שעות 1 x 10 6 תאים בבית dynes 15 / 2 ס"מ 6. באיור 1. סכמטי המציג סקירה של הרכבה זרימת מעגל ולהתנסות לזרום. (א) מעגל זרימה הרכבה ללא תא הזרימה. כלול הנה המאגר, הדופק dampener, צינורות קשיחים, צינורות רכה, 4-way והברזים למיניהם ומתאמים luer מחובר, כמו גם מסנן אוויר. (ב) חיבור קאמרית זרימה דרך קטע צינור קשה בראשו משאבת זרימה. (ג) sertion של השקופית EPC-seeded לתוך צלחת התחתון של החדר זרימה (ד '). השלם הרכבה של המעגל לזרום עם תא זרימה. באיור 2. הזרימה במעגל התאספו לחלוטין עבור עיקור. באיור 3. מעגל זרימה Assembled לאחר עיקור עם והברזים למיניהם כלל. איור 4. מילוי המאגר זכוכית עם 125 מ"ל של מדיום EPC. איור 5. תזרים מעגל הידק לתוך הראש את המשאבה תזרים לפני הכניסה לתא לזרום. jpg "/> איור 6. הרכבה למעלה צלחת קאמרית. איור 7. בפלאשינג את מלכודת בועה עם המדיום EPC כדי להסיר בועות יבוא מהצד של החדר. איור 8. בפלאשינג את החדר עם המדיום EPC כדי להסיר בועות משקופית ועל הצד יצוא של החדר. איור 9. לחלוטין התאספו במעגל לזרום עם תא זרימה מוכנס במהלך הניסוי זרימה. איור 10. אזור EPC (ב מיקרומטר 2) מגבירה במשך זמן הניסוי לזרום. files/ftp_upload/3349/3349fig11.jpg "/> איור 11. (א) התמונה של מיקרוסקופ אור HUCB EPCs seeded לשקופית פיברונקטין זכוכית מצופה x 6 שעות לפני זרימת בהגדלה של 100 x. (ב) HUCB EPCs שכותרתו עם CTO ומהיר seeded לשקופית טי x 15 דקות לפני זרימה, דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 100 x. (ג) להחליק אותו עם טי EPCs HUCB כמו תחת (ב), אחרי 3 שעות של זרימה ב 100 dynes / 2 ס"מ ו – הדמיה באמצעות תא שקוף בהגדלה של 100 x. הערה כיוון התפשטות של תאים אבל עדיין אקראיים אחרי 3 שעות של זרימה. (ד) להחליק אותו טי, עכשיו לאחר 48 שעות של חשיפה תזרים בהגדלה של 100 x. EPCs מסומנים עם CTO ו גרעיני תאים מגואלות Hoechst צבע (כחול) לאחר זרימה. שים את יישור התאים כיוון הזרימה. (ה) EPCs חזירי להשוואה על טי לאחר 48 שעות של זרימה dynes 15 / ס"מ <sup> 2 של חשיפה ללחץ גזירה. גבולות התא הוכתמו אנטי PECAM כתם (ירוק) ו – גרעינים עם Sytox חומצה אורנג' גרעין הכתם. הערה יישור של תאים לתוך כיוון הזרימה. גרף איור 12. מתארת ​​NO ייצור EPCs חזירי במהלך 48 שעות של זרימה. המוצר העיקרי של חמצון NO, ניטריט (NO 2 -), נמדדה כסמן פונדקאית עבור NO ממדגמים בינוני שנאספו בנקודות זמן שונות במהלך הזרימה. איור 13. תא זרימה מורכב ממלאי סגסוגת אלומיניום 6061 מלבנית, עם החלק העליון (A) להיות 0.5 "x 2" x 7 "ואת החלק התחתון (B) 0.25" x 2 "x 7" בממד. העליון הואמהוקצע בחלק התחתון פני השטח שלו קשר O-Ring על 0.45 "על מנת להבטיח את שטיחות לאיטום. החלק העליון הוא השקוע בחלק במרכזו כדי 0.125", מה שמשאיר 0.95 "סוף לכל תמורת 0.3125" המאגר x "1.375 נוזל. המאגר סעיף למעלה הוא מושחל 3/8-24 TPI ו – 0.25 "עמוק לקבל הליכי תקעים נירוסטה. מכונות מדידה 1 / 16 "x 0.625" היו במכונה לתוך התחתון כי לחדור אל המאגר. תקע צד יבוא יש 10/32 "דרך החור של פוליפרופילן 1 / 8" עקיצה צינור לצרף שסתום. בסוף כל יחידה יש ​​במיקום מרכזי מושחל 10/32 TPI של 0.25 "חלק עמוק פוליפרופילן 1 / 8" עקיצה הצינור סוף 0.45 "x 2". מסתיים להשתמש .07 "חור מהחלק התחתון של הנושאים דרך לחדור אל המאגר. התחתון של החלק העליון יש אזור מחודדות 0.6875" רחב, 0.518 מעלות ממרכז חריץ LH למרחק של 1.460 ". זה להתחדד תערובות לאזור שטוח 0.6875 "רחב x 0.0118" עמוק 0.590 "מסוף גלאסs (או משטח אחר, כגון שקופית טיטניום) בהפסקה. שטוח זה חייב להיות מיושר עם זכוכית (או משטח אחר, כגון טיטניום שקופיות) אחת את השקופית מותקן. להתחדד ושטוח הם מלוטשים. המשטח של השקופית היא 0.0118 "הפסקה מפני השטח התחתון. .0118" ההפסקה ממשיכה חריץ המאגר בקצה RH. O-Ring היא הפסקה לגמרי סביב חריצי והחלק עוזב 0.020 "של המשטח המקורי בין חריץ טבעת O והחלק. חלקו העליון ויחידות התחתונה הם קדחו חורים עשר. בחלק העליון יש חורים אישור עבור 8 / 32 TPI המשוקעים שטוח הברגים בראש. המקטע התחתון יש חורים להציב תואמים את החורים העליון הם הליכי 8 / 32 TPI. יחידת התחתון יש זכוכית שקופה שקופית חלון שטוף הפסקה עם משטח הממוקם מעל השקופית משטח זכוכית תא (או מחליק טיטניום). היחידה יש חריץ O-Ring הכולל חריצי ביחידה העליונה עם רוחב לעזוב 0.04 "של המשטח המקורי בין שקופיות התחתון ואת חריץ פנימי O-Ring. O-rinGS אדומות סיליקון AS568A, מספר דש 044 עבור החלק העליון 046 עבור בחלק התחתון.