재조합 Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 생산 및 Titering

다음과 같은 프로토콜을 요약 보여주기위한 그림 1을 참조하십시오. 안전주의 : 조립 바이러스 입자들과 접촉을 해 왔습니다 모든 자료 Virkon 솔루션 또는 기타 적합한 살균제로 소독해야합니다. 1. 플라스미드 DNA 주식 (~ 2 일)의 준비 다음 plasmids는 1이 필요합니다 : pRV1 – AAV2 담당자와 모자 시퀀스를 포함 pH21 – AAV1 담당자와 모자 시퀀스를 포함 pFdelta6 – 아데노 바이러스 – 헬퍼 플라스미드 플라스미드 AAV는 AAV2 포장 신호 (거꾸로 터미널 반복, ITRs) 어귀 재조합 표현 카세트를 포함하는 pFdelta6이 부분 삭제를 방지하기 위해 Stbl2 유능한 세포 성장해야하지만, pRV1와 pH21는 DH5alpha 유능한 세포의 성장 수 있습니다. 부분 삭제가 DH5alpha 세포에서 발생하는 경우에는 AAV의 plasmids은 Stbl2 세포의 성장 수 있습니다. 플라스미드 DNA는 고품질의 RNA 오염 물질의 무료 있어야합니다. Plasmids는 다음과 소화를 사용하여 무결성 검사를 할 수 있습니다 : pRV1 – 소화와 XbaI은 7.5 킬로바이트 및 3.8 킬로바이트의 밴드를 제공 pH21 – EcoRI로 소화 4.5 킬로바이트의 밴드 2.8 킬로바이트 및 0.2 킬로바이트를 제공 pFdelta6 – HindIII와 소화가 5.5 킬로바이트의 밴드, 3킬로바이트, 3킬로바이트 2.3 킬로바이트 및 1.5 킬로바이트를 제공 2. (- 3 일 2) transfection에 대한 인간의 배아 신장 293 (Hek293) 세포의 준비 플레이트이 80% 합류 150cm 다섯 15cm 직경 Nunc 조직 문화 요리에 Hek293 전지 2 flasks. 세포는 70해야 – transfection (약 48 시간이 도금 후) 전에 80% 합류. 10% 소태아 혈청과 100 U / ML 페니실린 / 100 μg / ML 스트렙토 마이신을 포함하는 낮은 포도당 표준 Dulbecco의 수정 독수리 중간 (DMEM)에 문화 세포. transfection 전에 3 시간 DMEM을 제거하고 Iscove로 교체의 수정된 Dulbecco의 중간 (IMDM)는 소태아 혈청 5 %를 포함. 3. 바이러스 plasmids의 Transfection (transfection에 대해 ~ 1 시간 부화 3 일) 바이러스의 단일 배치 (5 X 15cm 조직 문화 플레이트)에 대한 다음과 같은 준비 : 플라스미드 62.5 μg AAV 125 μg pFdelta6 31.25 μg pRV1 31.25 μg pH21 1650 μl 2.5 M CaCl 2 12 ML DH 2 O 50 ML 튜브에 2 급 조직 문화 후드 살균 필터 transfection 혼합물에. 솔루션을 vortexing 반면, 신속하게이 X의 HEPES 13 ML을 추가 (산도 7.05) 염분 버퍼. 50 ML 튜브의 뚜껑을 교체하고 15 초 동안 와동로 진행합니다. 일분 45 초 동안 서 떠나 훌륭한 흰색 침전물이 형성됩니다. 부드럽게 각 15cm 조직 문화 요리에 transfection 솔루션의 5 ML를 추가합니다. 소용돌이 모양의 접시는 믹스 앤 인큐베이터로 돌아갑니다. transfection 후 16시간은 IMDM 미디어를 제거하고 DMEM로 바꿉니다. 4. (2 시간) 세포의 Lysing 및 rAAVs의 수확 transfection 후 72 시간, 세포 배양 접시에서 미디어를 제거하고 폐기. 모든 폐기물은 Virkon 솔루션 또는 기타 적합한 살균제로 소독 치료를해야합니다. 부드럽게 따뜻한 1X 인산염의 세포를 세척 식염수는 (; 산도 7.4 PBS) 버퍼. 각 판 25 ML 따뜻한 PBS를 추가하고 부드럽게 세포 스크레이퍼와 세포를 제거합니다. 50 ML 튜브의 중지를 수집합니다. 10 분 800 XG에 펠릿 세포. NaCl 150 MM, 20 MM 트리스 산도 8.0에서 뜨는 및 resuspend 펠렛을 폐기, 조직 문화 판 당 10 ML을 사용합니다. 이 50 ML 튜브로 가라. DH 2 O.에서 10 %의 나트륨 deoxycholate의 새로운 솔루션을 준비 0.5 %의 최종 농도 각 튜브에이 1.25 ML을 추가합니다. ML 당 50 단위의 최종 농도 benzonase nuclease를 추가합니다. 철저하게 튜브를 섞습니다. <l저는 37> 품어 ° C 1 시간. 15 분에 대한 3000 XG에 centrifuging하여 세포 파편을 제거합니다. 신선한 50 ML 관에 전송 모든 세포 부스러기가 (5 단계 참조) 헤파린 열 차단 방지하기 삭제되었습니다 보장합니다. 이 단계에서는 샘플을 계속하기 전에 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. 우리는 감염의 감소없이 -20 ° C에서 몇 주 동안 샘플을 저장합니다. 5. rAAVs의 헤파린 열 정화 (2-3시간) 해당 솔루션은 흐름 있도록 5.4 단계 5.2에 대한 분당 1 ML에있는 컬럼을 통해 연동 펌프를 사용하여 설치 HiTrap의 헤파린 열. 기포가가 헤파린 컬럼에 도입되지 않도록하는 것이 중요합니다. 10 ML 150 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0로 컬럼을 평형. 칼럼 50 ML 바이러스 솔루션을 적용하고 흐름을 통해 수 있습니다. 20 ML 100 MM NaCl, 20 MM 트리스, pH를 8.0로 컬럼을 씻으십시오. 5 ML의 주사기를 사용하면 열 w을 씻어 계속한 ML 300 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0 다음​​ ith 일 ML 200 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0,. 흐름을 통해 폐기하십시오. 적용하여 열에서 5 ML 주사기와 부드러운 압력 elute 바이러스를 사용 : 1.5 ML 400 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0 3.0 ML 450 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0 1.5 ML 500 MM NaCl, 20 MM 트리스, 산도 8.0 15 ML의 원심 분리기 튜브에서 이러한를 수집합니다. 6. 농도와 rAAVs의 무균 여과 (1 시간) 100,000 분자량의 컷오프와 Amicon 울트라 – 4 원심 필터 유닛을 사용하여 벡터를 집중. 이분 (실온에서) 2000 XG에 농축기와 원심으로 열 eluate 4 ML을로드합니다. 나머지 바이러스 솔루션과 반복 원심 분리와 flowthrough 및 재장전 농축기를 폐기하십시오. 집중 볼륨 약 250 μl해야합니다. 집중 볼륨이보다 훨씬 더 많은 경우, 흐름 T를 폐기hrough는 볼륨이 약 250 μl 때까지 일분 단계에서 원심 분리기를 계속합니다. 500 μl의 최종 볼륨 바이러스에 PBS 250 μl를 추가하고 농축기에서 제거합니다. 13mm 직경 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 필터 벡터. 벡터는 ° C까지 필요한 -80에서 aliquoted하고 저장해야합니다. 7. (3 일간) 바이러스 주식 Titering 이 기자의 유전자 또는 유전자 immunocytochemically 감지 제품을 운전 Hek293 세포에서 활성화되어 발기인이 필요합니다. Hek293 세포는 다른 세포 라인이나 기본 셀 문화가 사용할 수와 호환되지 않습니다 벡터를 제작하는 경우. 50% 합류 – 그들이 40되도록 Hek293 세포를 시딩하여 18 폴리 – L – 라이신 코팅 유리 coverslips 또는 Nunc 챔버 슬라이드 18 우물을 준비합니다. Cre – 의존 rAAVs의 적정 위해 안정 표현 Cre recombinase이 Hek293 세포를 사용합니다. 시리얼 D 각각 잘 감염AAV 벡터 (그림 2A)의 ilutions. 희석 당 3 우물을 사용합니다. 우리는 일상적으로 각각 물론 직접 바이러스를 추가합니다. 72시간은 실온 10 분 (2 % PFA의 최종 농도를주는) 중간에 4 % paraformaldehyde의 동일한 볼륨 (PFA)를 추가하여 Hek293 세포를 수정 후. 세포에게 PBS로 세 번 씻어, DH 2 O와 coverslip에 린스. 가장 높은 희석 요인을 세 우물에서 transduced 세포의 수를 세어하지만 여전히 감염된 세포를 포함하는 이들의 평균을 찾아 microliter 당 전염성 단위 (그림 2B)의 번호를 가르쳐주기 희석 요소를 기준으로 곱하면됩니다. 8. 예상 결과 Hek293 세포는 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)가 그림 2B에 표시하는 바이러스 인코딩 transduced. 우리는 일반적으로 마이크로 리터 당 약 6 × 10 6 전염성 입자의 일관성 titers을 얻을 수 있습니다. 우리는 일상적으로 stereotaxic 인제 이러한 벡터를 사용성인 쥐 두뇌에 ction. 이것은 특정 지역과 관련된 유전자 발현 2에 대한 강력한 기술을 제공합니다. 우리가 Cre – 형질 전환 마우스 2 대상 지역으로 Cre recombinase 종속 rAAVs을 주입 셀 타입의 선택적 유전자 발현이 지역의 특이성을 결합합니다. 그림 2C – E는 성인 parvalbumin – Cre 유전자 변형 마우스 3 가지 뇌 영역에 eGFP 인코딩 Cre – 의존 rAAVs의 stereotaxic 주사의 예를 보여줍니다. 그림 1. rAAV 생산을위한 프로토콜의 도식 그림. 1.) Hek293 전지는 도금 및 70 재배 – 80 % 합류합니다. 2.) AAV와 도우미 plasmids은 준비하고 Hek293 세포로 transfected 수 있습니다. 3.) 매체는 transfection 후 DMEM 16시간으로 변경되고 Hek293 세포는 다른 56시간에 대한 양식입니다. 4.) Hek293 세포는 수확 및 lysed 있습니다. rAAV 벡터는 C에 의한 세포의 잔해로부터 분리entrifugation. 5.) 바이러스성 입자 농도 및 살균하기 전에 헤파린 컬럼을 통해 정화됩니다. 6.) Hek293 세포 24 잘 접시에 성장과 전염성 단위의 수를 결정하는 AAV 벡터의 시리얼 dilutions로 감염됩니다. 그림 2. Titering 및 rAAV1 / 2의 생체내 응용 프로그램 인치 바이러스 titer를 측정 Hek293 세포의 (A) 설정. Hek293 세포 rAAVs 일련 dilutions와 transduced 있습니다. C, 감염되지 않은 제어, N, undiluted 바이러스 주식 1 μl. (B) Hek293 세포 eGFP을 표현 rAAVs에 감염. (CE) 바이러스성 eGFP 표현은 제한됩니다 Cre – 표현 Cre가 활성화된 rAAVs의 stereotaxic 주입 후 parvalbumin – Cre 유전자 변형 마우스의 다른 대상 지역에서 뉴런합니다. 예 이미지 (C) 망상 시상 및 globus pallidus에서 GFP의 immunoreactivity를 보여, (D) 이가있는 이랑과 해마의 (E) CA1 지역. DG, 드ntate 이랑, RT, 망상 thalamic 핵, GP, globus pallidus의. 스케일 바 : B, 500 μm의, C, 100 μm의, D, 100 μm의, 전자, 500 μm의.