T-labyrinthe alternance forcé et des tâches de discrimination gauche-droite pour l'évaluation de travail et de la mémoire de référence chez la souris

1. Dispositif réglage La boîte automatique modifiée labyrinthe en T appareil (O'HARA & Co., Tokyo, Japon) est construit de blanc pistes en plastique avec 25 cm de hauts murs 1. Le labyrinthe est cloisonné en 6 zones (A1, A2, S1, S2, P1, P2) par des portes coulissantes (s1, s2, s3, a1, a2, p1, p2) (figure 1) qui peut être automatiquement ouvert vers le bas. La tige du T est composé d'aire S2 (13 x 24 cm) et les bras du T comprennent des zones A1 et A2 (11,5 x 20,5 cm). P1 et P2 zones comprennent les canaux de liaison du bras (zone A1 ou A2) dans le compartiment de démarrage (S1 dans la région). La fin de chaque bras est équipé d'un distributeur de pastilles de qui vous fournit automatiquement une teneur en saccharose (20 mg, la formule 5 TUT, TestDiet, Richmond, IN, États-Unis) à granulés comme une récompense. L'apport par le culot de la souris est détectée par le capteur infrarouge et est automatiquement enregistrée par un ordinateur. Le Coupled Device charge (CCD) est monté au-dessus de l'appareil pour surveiller la souris & #x2019; comportement s, et les images de l'appareil et de la souris sont capturés par l'ordinateur. Placez l'appareil T-labyrinthe dans une salle insonorisée (170 x 210 x 200 cm, O'HARA & Co., Tokyo, Japon) que possible. L'appareil est éclairé par des lampes fluorescentes à 100 lux dans notre laboratoire. L'intensité lumineuse pourrait être plus faible que ce niveau de lux, mais doit être maintenu à un niveau constant pendant toutes les expériences. 2. La préparation des animaux Maison de deux à quatre souris par cage dans une pièce à température contrôlée (23 ± 2 ° C) avec un 12-h cycle jour / nuit (lumières sur au 7:00), selon les orientations et les protocoles établis par les soins des animaux locale et l'utilisation Comité. Transfert de toutes les cages contenant les souris dans la salle insonorisée de la salle de loger au moins 30 min avant le premier procès commence. Toutes les expériences doivent être toujours effectuée au cours de la même période (par exemple, de 9h00 à 18h00). Au cours de la pe testriode, les sujets de chaque génotype ou de la condition expérimentale devrait être testé dans un ordre contrebalancé, car il pourrait y avoir un effet potentiel du temps dans une journée sur la performance de la tâche. 3. La restriction alimentaire Jusqu'au début de l'expérience, donner libre accès à la norme culot chow et de l'eau à des souris. De 1 semaine avant les sessions de pré-formation, peser les souris quotidiennement et de les nourrir à la norme culot chow de maintenir 80% à 85% de leur poids corporel de libre-alimentation tout au long de l'expérience. Fournir tous les jours avec huit boulettes de saccharose par la souris en plus à la norme culot chow dans leur cage pour habituer aux granulés de saccharose jusqu'au début des sessions de pré-formation. 4. L'accoutumance à l'appareil et de pré-formation S Placepastilles saccharose ix par souris vers le centre de chacun des six compartiments de l'appareil, et dépose un granulés dans chaque plateau des distributeurs de produits alimentaires. Placez toutes les souris dans une cage dans l'appareil et leur permettre d'explorer librement l'appareil avec toutes les portes ouvertes pendant 30 min. De 1 jour après l'accoutumance, les souris sont soumis quotidiennement à de pré-formation. Avec toutes les portes fermées et le culot déposées dans le bac alimentaire, la souris lieu dans la zone A1. Si la souris consomme l'écoulement min granulés ou 5, de transférer la souris pour la zone A2 et de commencer à pré-formation à nouveau. Cette formation est répétée cinq fois par jour, et a continué jusqu'à ce que les souris consomment plus de 80% des granulés. Après les sessions de pré-formation sont complets, les souris sont soumis soit à une tâche d'alternance travail forcé ou tâche de discrimination gauche-droite. 5. Tâche alternance forcé Dans la tâche d'alternance forcée, chaque essai se compose d'un fol course à choix forcésuivie d'une course libre choix. Exécutez le programme d'application (image TM) pour le début de la tâche, et placer une souris dans la zone de départ (S1 région). Cliquez sur le bouton de démarrage, et une course à choix forcé commence. Dans cette course, les portes de zone de départ (la porte s2) et de la zone soit A1 (porte a1) ou de la zone A2 (a2 porte) sont ouverts, et une pastille de saccharose est automatiquement envoyé vers le plateau des aliments de la région avec la porte ouverte . La souris est autorisé à entrer dans la zone et à consommer le culot. Lorsque la souris a consommé de la pastille, la porte près du plateau alimentaire du bras que le reste de la souris actuellement (p1 ou p2 porte soit) est ouvert. Ensuite, la souris se rapproche de la porte (soit S1 ou S3) voisine de la zone de départ, et soit le p1 ou p2 porte est fermée et les s1 porte (ou S3) est ouvert de telle sorte que la souris peut revenir à la boîte de départ. Si la souris ne mange pas le culot dans les 30 secondes, la réponse est enregistrée comme une «erreur d'omission». Puis, le culot est automatiquement retiré de la barquette alimentaire et til porte du bras que les souris sont restés (P1 ou P2) est ouvert, puis la souris peut revenir à la boîte de départ. Après la course à choix forcé, la course libre choix commence automatiquement. La porte et les deux portes s2 a1 et a2 sont ouverts. La souris est autorisé à choisir entre les deux bras. Si la souris entre dans le bras opposé qu'il a été forcé de choisir dans la course à choix forcé, sa réponse est considérée comme «correcte» et la souris reçoit une pastille de saccharose. Si la souris ne mange pas le culot dans les 30 secondes, la réponse est enregistrée comme une «erreur d'omission», et le culot est automatiquement retiré de la barquette alimentaire. Si la souris passe sur le bras de même que celui visité dans la tâche de choix forcé, la souris est confinée dans la zone pendant 10 sec à titre de pénalité ("Erreur" réponse). Puis, les portes de p1 (ou S1) et P2 (ou s3) sont ouverts, et la souris peuvent revenir à la boîte de départ. Une souris est soumis à 10 essais consécutifs à une séance parjour (coupure du temps, 50 min). Les souris témoins sont formés par jour pour atteindre une moyenne de groupe de la réponse correcte à 80% en une séance. La moyenne du groupe de la réponse correcte est calculée en faisant la moyenne des réponses correctes% de chaque souris dans une session de chaque groupe. Après les souris témoins et / ou expérimentales sont formés pour le critère, vous pouvez continuer à tester les souris dans la tâche alternance différée par l'insertion, 3 -, 10 -, 30 -, ou 60-S retards entre le choix forcé et le libre-choix s'exécute. Après chaque session, le retour des souris dans leur cage d'origine, et de nettoyer l'appareil avec de l'eau hypochloreux super (pH 6-7) pour éviter un biais sur la base de signaux olfactifs. 6. Tâche de discrimination gauche-droite Dans la tâche de discrimination gauche-droite, chaque souris est donnée une course libre choix de 10 ou 20 essais. Une pastille de saccharose est toujours sur le plateau de l'alimentation de l'un des bras, à savoir, le bras objectif. Les souris ont à apprendre à entrer dans le bras de but. L'emplacement de l'objectifbras est invariable dans tous les essais et les séances, et est contrebalancée dans les souris contrôles et expérimentaux. Exécutez le programme d'application (image TM) pour le début de la tâche, et placer une souris dans la zone de départ (S1 région). Cliquez sur le bouton de démarrage, et une course libre choix commence. Dans cette course, la porte s2 et les deux portes A1 et A2 sont ouverts, et un distributeur de pastilles de délivre automatiquement une pastille dans le bac alimentaire du bras objectif. La souris est autorisé à choisir librement entre les bras gauche et droit. Lorsque la souris pénètre dans le bras objectif, il est considéré comme une réponse correcte. Si la souris mange la pastille ou 30 s s'écouler, p1 porte (ou p2) est ouvert. Lorsque la souris se rapproche de la zone de départ en passant à travers l'espace P1 (ou P2), s1 porte (ou s3) est ouvert de sorte que la souris peut revenir à la zone de départ. Une souris est généralement soumis à de 10 à 20 essais consécutifs à une session par jour (temps de coupure, 50 min). Les souris témoins sont formés par jour pour atteindre une moyenne de 80% du groupe correct réponse à une session. La moyenne du groupe de la réponse correcte est calculée en faisant la moyenne des réponses correctes% de chaque souris dans une session de chaque groupe. Après les souris atteindre le critère, vous pouvez donner des séances supplémentaires pour les souris, soit pour évaluer la mémoire de rétention et le réapprentissage en insérant un retard de plusieurs semaines entre les séances ou pour évaluer la flexibilité comportementale en plaçant la récompense dans le sens opposé, le bras précédemment appâtés (c.-à-inversion l'apprentissage), le cas échéant. Après chaque session, le retour des souris dans leur cage d'origine, et de nettoyer l'appareil avec de l'eau hypochloreux super (pH 6-7) pour éviter un biais sur la base de signaux olfactifs. 7. L'analyse d'image Comportements dans l'appareil T-labyrinthe sont enregistrées par une caméra vidéo reliée à un ordinateur et l'image est stockée dans un format TIFF. L'application utilisée pour l'acquisition et l'analyse des données comportementales (Image TM) est basé sur l'image de domaine programme public J (développé parWayne Rasband à l'Institut national de la santé mentale et disponible à http://rsb.info.nih.gov/ij/ ), qui a été modifié par Tsuyoshi Miyakawa (disponible par le biais O'HARA & Co., Tokyo, Japon). Le programme Image TM génère automatiquement les fichiers texte pour le pourcentage de réponse correcte, la latence (s) pour compléter une session, la distance parcourue au cours de la session, et le nombre d'erreurs d'omission dans la session. En outre, les images des traces de la souris, les données de position premières, et les données de réponse premières (correcte, une omission ou une erreur) dans chaque série sont produites et enregistrées. 8. L'analyse statistique Analyser les données comportementales par chacun dans les deux sens (condition expérimentale (par exemple, GENOTYPE) SESSION x ou CONDITION EXPERIMENTALE RETARD x) analyse de mesures répétées de la variance. 9. Les résultats représentatifs Un exemple de labyrinthe en T performance en α-CaMKII + / – maLe souris et leurs littermates de contrôle de type sauvage (C57BL/6J arrière-plan) (11-18 semaines d'âge, n = 10 par groupe pour l'alternance forcée ou d'une tâche de discrimination de gauche à droite) est représenté dans les figures 2-4. Parce que α-CaMKII + / – souris présentent des niveaux élevés d'agressivité envers leurs compagnons de cage 2,3, à la fois les mutants et les souris de contrôle ont été hébergés individuellement dans une cage en plastique (22,7 x 32,3 x 12,7 cm) après le sevrage. Les expériences ont été approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation de Fujita universitaire en santé. Dans la tâche d'alternance forcée, les souris de contrôle de plus en plus apprendre à faire les bons choix, et peuvent généralement atteindre le critère d'une réponse correcte moyenne de 80% en environ 1 à 2 semaines (figure 2A). Par rapport aux souris témoins, α-CaMKII + / – des souris a montré un pourcentage significativement plus faible de réponses correctes (génotype: F (1,18) = 29.04, p <0,0001) et une latence plus courte (génotype: F (1,18) = 8.88 , p = 0,008; GENOTYPE x SESSION: F (9162) = 2,24, p = 0,0218) et a voyagé plus courte distance (génotype: F (1,18) = 8,67, p = 0,0086; GENOTYPE x SESSION: F (9162) = 3,19, p = 0,0014) que les souris témoins (figure 2A, B, et C). Aucun effet significatif du génotype a été trouvé dans les erreurs d'omission (figure 2D). En outre, dans la tâche alternance différée, les pourcentages de choix corrects de α-CaMKII + / – ont été nettement inférieurs à ceux des souris de type sauvage, à tout moment retard (génotype: F (1,18) = 38,781, p <0,0001; RETARD : F (3,54) = 8,074, p = 0,0002; GENOTYPE x RETARD: F (3,54) = 0,223, p = 0,88; figure 3). Ces résultats indiquent que les mutants affiché des performances amoindries par rapport aux souris témoins, bien que les souris mutantes pourraient accomplir la tâche plus vite que les témoins, ce qui suggère que α-CaMKII déficit induit un déficit de mémoire de travail. Dans la tâche de discrimination gauche-droite, les pourcentages choix correct de la α-CaMKII + / – mutants progressivement augmenté à travers des sessions, semblables à des souris témoins (figure 4A). Aussi, quand un délai de 1 mois a été inséré entre les sessions, Il n'y avait pas de différences significatives dans le pour cent correct entre les souris mutantes et de contrôle. Comme dans la tâche d'alternance forcée, α-CaMKII + / – mutants ont montré un temps de latence beaucoup plus courte pour terminer une session (génotype: F (1,18) = 12.12, p = 0,0027) et plus courte distance parcourue dans l'appareil lors d'une session (GENOTYPE : F (1,18) = 25.08, p <0,0001; GENOTYPE x SESSION: F (15 270) = 2,83, p = 0,0004) que les souris de contrôle à travers des sessions de formation (figure 4B et C). Ces données indiquent que la dose carence en α-CaMKII pas d'incidence sur la mémoire de référence évaluée par cette tâche. Au cours des séances d'inversion-learning, cependant, α-CaMKII + / – mutants ont montré un pourcentage significativement plus faible de réponses correctes (génotype: F (1,18) = 10,92, p = 0,0039; GENOTYPE x SESSION: F (5,90) = 5,54, p = 0,0002; figure 4A) et a eu des erreurs d'omission plus (génotype: F (1,18) = 17.12, p = 0,0006; figure 4D) que les souris témoins. Ces résultats suggèrent que α-CaMKII + / – souris mutantes ont réduit la flexibilité comportementale. <p class = "jove_content"> Figure 1. (A) T-labyrinthe appareils pour l'alternance forcée et des tâches de discrimination gauche-droite. Le chiffre est cité par Takao et al. (2008). (B) L'image a été captée par une caméra CCD monté au-dessus de l'appareil. Le T-labyrinthe est cloisonné en 6 zones (A1, A2, S1, S2, P1, P2) par des portes coulissantes (s1, s2, s3, a1, a2, p1, p2). (C) de configuration et l'orientation des indices appareils et extra-labyrinthe dans une salle insonorisée. Deux appareils sont placés en regard dans la même direction vers un mur dans une pièce insonorisée, et des objets, comme une porte de la chambre, les lumières fluorescentes sur le plafond, les murs de la salle, caméras CCD des appareils et des supports pour accueillir la souris cages sont fixées. Figure 2. T-labyrinthe forcé tâche alternance. Les souris ont reçu 10 épreuves quotidiennes par session. Les données de (A) le pourcentage de réponses correctes, (B) de latence (s), (C) la distance parcourue (cm), et (D) le nombre d'erreurs d'omission représentés en tant que moyen avec des erreurs standard pour chaque bloc de deux sessions, et étaient analysés par une analyse de variance à deux voies à mesures répétées. α-CaMKII + / – souris ont montré un plus faible pourcentage de réponses correctes (p <0,0001) et une latence plus courte (p = 0,008), et parcouru une distance plus courte (p = 0,0086) que les souris témoins entre les sessions. Figure 3. T-labyrinthe forcé tâche alternance avec des retards de 3, 10, 30 et 60 sec. Environ 24 h après la dernière séance d'entraînement, les souris ont été soumis à cinq séances de retard. Le pourcentage de réponses correctes pour chaque retard est représenté en tant que moyen avec des erreurs standard, et ont été analysés par une analyse de variance à deux voies à mesures répétées. α-CaMKII + / – souris ont montré un plus faible pourcentage de réponses correctes que les souris témoins à tout retardle temps (p <0,0001). Figure 4. T-labyrinthe tâche de discrimination gauche-droite. Les souris ont reçu quotidiennement 10 ou 20 essais dans une session. Les données de (A) le pourcentage de réponses correctes, (B) de latence (s), (C) la distance parcourue (cm), et (D) le nombre d'erreurs d'omission sont représentés en tant que moyen avec des erreurs standard pour chaque bloc de 20 essais, qui ont été analysés par une analyse de variance à deux voies à mesures répétées. Au cours des sessions de formation initiale et les séances de réapprendre un mois après la dernière séance d'entraînement, le pourcentage de réponses correctes ne différaient pas significativement entre les α-CaMKII + / – mutant et les souris témoins. Les souris mutantes, cependant, a montré un pourcentage significativement plus faible de réponses correctes que les souris témoins au cours des séances d'apprentissage d'inversion (p = 0,0039).