Hücreler NRCC Patch-klemp Chips kültür ve Elektrofizyoloji

1. Chip imalat 3 mikron kalınlığında kendi başına durabilen bir film, düşük 1 Mohm erişim direnci ve hücre 9 ile samimi bir mühür kolaylaştıran bir düz yüzeyli huni şekilli diyafram 6 sonuç açıklanan süreç, şekil 2'ye bakınız. Cips çipi bir yeraltı kanalına bağlayan bir delik karşı karşıya diyafram ile singulated ve pleksiglas paketleri yapıştırılmalıdır. Yapıştırma nominal 17 pF, şant kapasitans en aza indirir bir şekilde dağıtılır. Paketleri iki adet 1.5 mm çapında ve akışkan limanlar olarak 6 mm uzunluğunda cam tüpler (Şekil 3) ile donatılmıştır. Şekil 2 yama klemp bir NRCC çip odaklı iyon demeti bölümünde elektron mikroskobu Tarama yumuşak bir silikon dioksit yüzey ve samimi hücre bağlantıları yana huni şekli ve sığ bir delik düşük bir erişim dayanımı hesapları olduğunu gösterire. Şekil 3,, yeraltı akışkansal ve cam tüpler ile donatılmış bir Pleksiglas paketi, bir çip içinde, kültür flakonun dibinde yapıştırılır. 2. Sterilizasyon, doldurma ve test Aşağıdaki adımları, diyafram kirlenme veya tıkanmayı önlemek için bir biyoloji güvenlik kabini yapılmalıdır. 18 W. Diğer hava plazma sistemleri maksimum güçte 15 dakika için 0.1-0.3 mbar artık hava basıncı ile harrick temel plazma temizleyici (www.harrickplasma.com) cips sterilize karşılaştırılabilir güç yoğunluğu (24 mW ile kullanılabilir / cm 3) ve güç yoğunluğu ve ürünün sabit tutmak. Plazma tedavisi de astar kolaylaştıran, cips hidrofilik vermektedir. Steril silastik Laboratuvar silikon tüp, 1mm ID x 2mm OD (Cole Parmer cam tüpler FitCat. # 96115-08) bir tarafında, 3 inç, diğer tarafta 1 inç. Hiçbir kabarcık tutulur emin olun, steril filtre standart Fosfat Tampon Çözeltisi (PBS) ile tüpler aracılığıyla akışkansal doldurun. 1 atm kısa kenarı PBS basınçlandırma ise uzun silikon tüp Clip. Delikten sızan, PBS bir havuz, flakon görünür olabilir. PBS basınçlı kaynağı Klip ve bu kaynağı kısa bir silikon tüp ayırmak. Flakon, PBS bir şırınga kullanılarak filtrelendiğini ile doldurun. Cl kısa tüp elektrot ve bir şişe içinde bir karşı elektrot ve Ag / Ag bırakın. 10pF ve 25pF arasında 300kohm ve 3Mohm ve şant kapasitans arasındaki empedans metre erişim direnci olduğunu onaylamak için kullanılır. Düşük bir dirence sahip bir çip, bir kaçak olması muhtemeldir ve bu hücrenin elektrofizyoloji 6 hızlı dinamikleri yakalamak olmayabilir gibi yüksek bir kapasitans kullanım için uygunsuz olarak kabul edilir. Daha düşük bir kapasitans ile bir yongaveya daha yüksek bir direnç, bir kabarcık delik içinde sıkışıp basitçe olabilir rağmen, takılı olarak kabul edilir. Bazı yonga, 1H sonra yeniden test edilmiş ve doğru elektrokimyasal empedans sahip bulundu. Akışkan kanalı steril deiyonize su ile yıkayın; üst flakonun boşaltılması ve aynı iki kez durulayın. Steril deiyonize su ile dolu steril bir kapta diğer çipleri ile yüklemek taze steril deiyonize su tüpleri ile paketlenmiş yonga sonra 30 dakika bırakın. Bu çipleri hidrofilik ve kirlenmeye karşı korunuyor kalmasını sağlar. 3. Hücre biyolojisi laboratuvarı cips hazırlama Aşağıdaki adımları aseptik teknikler kullanarak bir HEPA filtreli laminer akış kaputu yapılmaktadır, bu yordamı kullanılan tüm çözümler 0.22μm bir filtre kullanarak kullanmadan önce sterilize filtre edilmesi gerekir. HEPA filtreli bir laminer akış kaputun altında bir çip kutuyu açın ve conta fişleri kaldırmakasimtotik üst şişeye mümkün yüzen kirletici karıştırıyordu önlemek için yüz aşağı. Çip yüzeyde herhangi bir kalıntı enkaz kaldırmak için taze filtre steril deiyonize su ile çip 2x flakon üst durulayın. Üst flakon kapalı steril deiyonize su aspire edin. Silastik hortumu arasında akışkan kanalı steril süzülmüş deiyonize su içeren basınçlı bir şırınga ekli bir ucunu. Sistemimizde, solüsyonuyla doldurulmuş şırıngalar 20psi üzere ayarlanmış bir sıkıştırılmış hava tankı için bir bağlantı ile basınçlı hale gelirler. Sterilite sağlamak için, hava şırınga girmesinden önce (0.22 mikron filtre) filtre edilmiş ve bizim sistemi de gerektiğinde bize baskı durdurmak veya uygulamak için izin veren bir açma / kapama vanası vardır. Hortumu arasında çıkış ucu kullanarak, bir hemostat kelepçe. Çözüm basınç / vanaları kapatın açın. Taze steril deiyonize su ile çip subterranen akışkan durulama, boru çıkış çözülme. Için içindiyafram aracılığıyla ce su, bir hemostat ile boru çıkış sonunda kelepçe. Suyu drenajı önlemek için bir hemostat birlikte, boru giriş ve çıkış uçları kelepçe ve / açma kapama vanaları kapatın. Şırıngadan boru giriş sonuna ayırın. Hortumun her iki ucunda cam fişleri takın ve hemostat çıkarın. Üst flakon, filtre steriled deiyonize su ile doldurun. 35 mm steril çanak kapağı 100 mm steril çanak üssü haline getirin 100 mm çanak kapağı ile 35 mm kapak ve kapağın üstünde yer çip. Görüntü cips cips membran ve diyafram enkaz ve / veya hava kabarcıkları serbest olmasını sağlamak için laboratuarımızda biz dik bir mikroskop ve 20x uzun çalışma mesafesi objektif kullanın. Enkaz ve / veya hava kabarcıkları varsa, akışkan kanalı ve üst flakon tekrar tekrar yıkayın. Enkaz ve / veya hava kabarcıkları kaldırıldı edilemezse çip atılır. Cips kezlaminer akış kapağı, görüntülü dönmek ve hortumun her iki ucunda çıkarın. Tek bir borudan ucunu fizyolojiksel ortam içeren basınçlı bir şırınga. , Bir hemostat ile hortumun çıkış ucunda Kıskaç Basınç vanasını açın, hemostat akışkansal çıkış ucundan kaldırmak ve, fizyolojik medya ile Mikroakışkan kanal yıkayın Yeraltı akışkan fizyolojik medya ile durulayın / vanaları kapalı, açık ve Hortumun çıkış hemostatı kaldırın. Fizyolojiksel ortam delikten zorlamak için, bir hemostat ile hortumun çıkış ucu kelepçe. Hemostat ile boru giriş sonuna Kelepçe ve / açma kapama vanaları kapatın. Hortumu plug şırınga ve her iki ucunda hortumu glas fişli giriş ucu çıkarın. Hemostat çıkarın. Üst şişeden su çıkarın. Filtre steril fizyolojik medya ile üst flakon doldurun. 100 mm petri içine çip geri yerleştirin. 35 mm çanak taban 100 mm kabına yerleştirin ve nem zenginleştirmek için filtre steril deiyonize su ile doldurun. Kaplama için zamanı gelene kadar çanak Kapak 4. Salyangoz nöronlarının hücre kaplama Yama-kelepçe yongaları, çeşitli preparatları için uygun olabilir. Şu anda memeli Primer kortikal nöron dökülmesinin test ve sterilizasyon protokolü yeterli olduğunu gösterir ve cips, uzun vadeli kültürlerinde sitotoksik olmadığı 14 gün 7, kültüre hücreleri ile elde edilen ilk sonuçlar. Onlar, nöronal elektrofizyoloji 11 okumak için basit ama köklü bir modeli temsil eder, çünkü bu bizim için en önemli sonuçları tarihi 10 edindiğiniz bu hücreler ile, bu protokolün amacı doğrultusunda, salyangoz nöronlarının seçilmiştir. Ayrıntılı hücre izolasyonu ve kültürü prosedürleri varÖnceden 12, 13 tarif edilmiştir. Çıkarın, Listerine içeren% 10 Lymnaea tuzlu künt forseps ve uyutmak hayvanlar ile 2-3 aylık Lymnaea stagnalis dış kabuk. Tüm sonraki basamaklar oda sıcaklığında sterilize diseksiyonu ekipman ve çözümleri ile bir laminer hava akımı kaput içinde aseptik yapıldı. Eppendorf pipet kullanarak uygun kayıt çözümü ile akışkansal fizyolojik ortam değiştirin. Durumda Lymnaea nöronların çözüm içerir (mM): 50 KCl, 5 MgCl2, 5 etilenbis (oxyethylenenitrilo) tetraasetik asit (EGTA) ve 5. 4 – (2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit (HEPES, pH 7.4. 130 mOsm) 14 Pin Lymnaea tuzlu su ile dolu bir Sylgard kabına salyangoz ve daha önce 13 olarak açıklanan tüm beyin kaldırmak Isolat tedavi18 dakika 15 dakika tedavi için DM ve tripsin inhibitörü (Sigma, Soya, Katalog # T-9003) takip ed tripsin enzimi ile tanımlanan medya beyinleri (DM) (% 0.2 'Çözüm, Sigma, Katalog # T-9201). (-; 1M glukoz çözeltisi 20 mL DM 750 uL glukoz eklendi DM HODM) medya tanımlanan yüksek ozmolarite dolu küçük Sylgard, çanak beyinleri Pin. Ince forseps ve diseksiyon makas kullanarak, nöronlar açığa ilgi gangliyonların dış ve iç kılıf çıkarın. , Ilgi (sol pedalı dorsal 1) hücre yakınındaki nazik emme uygulamak,, nöron beyin ayrılır ve, pipet içinde süspanse edilmekte kadar bir yangın cilalı cam pipet ile doldurulur HODM ve Mikroşırınga iliştirilir. Cam pipet sonra taşındı ve yumuşak sınırdışı mikroenjektör, nöronlar pipetle yavaşça dışarı itti ve fiş tek tek yama deliklerin üstüne yerleştirilir üzere sağlar bireysel neurochips daldırılır. Hücreleri, diyafram çevreleyen çip yüzeyine bağlılıklarını teşvik etmek için oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca rahatsız edilmeden oturup bekleyin. 5. Elektrofizyolojik kayıtlar (Bizim durumumuzda bir Multiclamp 700B amplifikatör, Molecular Devices, Foster City, CA, USA) amplifikatöre yongaları bağlamak için Çözüm, yeraltı Mikroakışkan ve uygun kayıt çözümleri ile çip şişe içinde değiştirin. , HEPES ile pH 7.9,, Lymnaea nöronların durumda üst kültürü odalarına (mM: 51,3 NaCl, 1.7 KCl, 4 CaCI2 ve 1.5 MgCİ2) Lymnaea tuzlu su ile doldurulmuştur tamponlu 14 Kararlılık için, yapıştırıcı bir cam slayt üzerine çip ve mikroskop altında yerleştirin. Amplifikatör (bizim durumumuzda bir Multiclamp 700B amplifikatör, Molecular Devices, Foster City, CA, USA) çip bağlamak için, hortumun bir ucunu kesti ve Silve eklemekr tel hangi kafa-sahne bağlanmıştır. Üste çipi şişe içinde referans elektrotu yerleştirin. Çip şimdi kayıt için hazırdır. Tüm hücreli (Rt = 50-100 M artı kapasitif geçişlerini, hücre ekli (R t> 1 GΩ) gösterge niteliğinde: toplam direncini ölçmek (Rt) ve nöronların yapılandırması belirlemek için amplifikatör ile bir 5 mV adım uygulayın ya da hiç mühür (M R t <5), membran diyafram üzerinde rüptürü). Son deneyler 10 hücreleri,% 58 oranında yüksek direnç contalar vardı ve bu hücreler,% 80 uyarılabilen yanıtları gösterdi. 6. Temsilcisi Sonuçlar Depolarizan akım darbeleri (20 pA artış), nöron (Bu durumda LPeD1 yılında) uygulayın. Vm yakın dinlenme potansiyeli (- 60 mV ~) nöron tutun. Depolarizan bakliyat tepkileri gözlemleyin. Overshooting aksiyon potansiyellerinöron uygulanabilir olup olmadığını görülebilir. Şekil 4, 14, 15 'de ayrıntılı olarak ele alınmaktadır temsili bir sonucunu göstermektedir. Şekil 4. Gerilim yanıtları intrasellüler akım darbeleri (aşağıda), kademeli dizi LPeD1 nöron (üstte). 60mV – akım darbeleri Vm = uygulanmıştır. Sorun Giderme Membran ve diyafram enkaz ücretsiz ve kaplama için uygun olup olmadığını kaplama önce, görüntü yongaları belirlemek için. Biz dik bir mikroskop ve 20x uzun çalışma mesafesi objektif kullanın. Bizim son deneyler 1, cips% 67 oranında başarıyla bu şekilde astarlanmalıdır. Enkaz ve / veya hava kabarcıkları varsa fiş atmak ve başka bir tane deneyin. Çeşitli yüzey işlemleri (plazma) veya kaplamalar (PDL, PEI vb.) Denenebilir, ancak başarı hücre tipine son derece bağlı olabilirkullanılmıştır. Kritik bir mühür giga-ve, bütün-hücre formasyonu için akışkan çözeltisi ("pipet") bileşimi. Osmolarite, pH ve iyonik makyaj dikkat, çözüm ayarlayın. Uzun vadede kültür için, sonra nazik yerçekimi beslemeli perfüzyon (~ 0.5 ml / dak) üzerinden kayıt önce çözüm Pipeti geçiş, mikroakışkan kanalı medya ile başlar.