एचआईवी 1 अनुक्रम विश्लेषण द्वारा Coreceptor का उपयोग (tropism) की भविष्यवाणी एक genotypic दृष्टिकोण का उपयोग
Summary
एचआईवी-1 के coreceptor के उपयोग की भविष्यवाणी एंटीरेट्रोवाइरल दवाओं, यानी coreceptor गरम का एक नया वर्ग के प्रशासन के लिए आवश्यक है. यह के अनुक्रम विश्लेषण के द्वारा किया जा सकता है<em> वातावरण</em> जीन और एक इंटरनेट आधारित व्याख्या प्रणाली के माध्यम से बाद में व्याख्या (geno2pheno<sub> [Coreceptor]</sub>).
Abstract
Maraviroc (MVC) is the first licensed antiretroviral drug from the class of coreceptor antagonists. It binds to the host coreceptor CCR5, which is used by the majority of HIV strains in order to infect the human immune cells (Fig. 1). Other HIV isolates use a different coreceptor, the CXCR4. Which receptor is used, is determined in the virus by the Env protein (Fig. 2). Depending on the coreceptor used, the viruses are classified as R5 or X4, respectively. MVC binds to the CCR5 receptor inhibiting the entry of R5 viruses into the target cell. During the course of disease, X4 viruses may emerge and outgrow the R5 viruses. Determination of coreceptor usage (also called tropism) is therefore mandatory prior to administration of MVC, as demanded by EMA and FDA.
The studies for MVC efficiency MOTIVATE, MERIT and 1029 have been performed with the Trofile assay from Monogram, San Francisco, U.S.A. This is a high quality assay based on sophisticated recombinant tests. The acceptance for this test for daily routine is rather low outside of the U.S.A., since the European physicians rather tend to work with decentralized expert laboratories, which also provide concomitant resistance testing. These laboratories have undergone several quality assurance evaluations, the last one being presented in 20111.
For several years now, we have performed tropism determinations based on sequence analysis from the HIV env-V3 gene region (V3)2. This region carries enough information to perform a reliable prediction. The genotypic determination of coreceptor usage presents advantages such as: shorter turnover time (equivalent to resistance testing), lower costs, possibility to adapt the results to the patients’ needs and possibility of analysing clinical samples with very low or even undetectable viral load (VL), particularly since the number of samples analysed with VL<1000 copies/μl roughly increased in the last years (Fig. 3).
The main steps for tropism testing (Fig. 4) demonstrated in this video:
1. Collection of a blood sample
2. Isolation of the HIV RNA from the plasma and/or HIV proviral DNA from blood mononuclear cells
3. Amplification of the env region
4. Amplification of the V3 region
5. Sequence reaction of the V3 amplicon
6. Purification of the sequencing samples
7. Sequencing the purified samples
8. Sequence editing
9. Sequencing data interpretation and tropism prediction
Protocol
Discussion
V3 क्रम में एक विश्वसनीय वायरल tropism भविष्यवाणी की अनुमति देता है, के रूप में नैदानिक अध्ययन 3-9 में दिखाया गया है. वास्तव में, वर्तमान में यूरोपीय और जर्मन ऑस्ट्रियाई 10 दिशानिर्देशों में genotypic दृढ़ संकल्प पर विचार किया गया है.
प्ररूपी परीक्षण की तुलना में, न केवल कारोबार कम समय (प्रतिरोध परीक्षण के बराबर) है, लेकिन यह भी खर्च कर रहे हैं. इसके अलावा, genotypic परीक्षण का एक बड़ा लाभ यह है कि परिणाम fpr के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं और इसलिए मरीजों की जरूरतों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. Trofile परिणाम, दूसरे हाथ पर, बस R5 या X4 रिपोर्टों, और कच्चे डेटा के लिए उपयोग नहीं दिया जाता है.
वर्तमान में, यूरोपीय दिशानिर्देश 20 10% की एक fpr काट सुझाव है, जबकि ऑस्ट्रियाई जर्मन दिशानिर्देशों का पूरी तरह पालन करते fpr आदत डाल प्रत्येक रोगी के 11 जरूरतों के लिए कट ऑफ विशेष रूप से अनुमति देते हैं. इस लाइन में, एंटीरेट्रोवाइरल दवाओं विकल्पों में से एक व्यापक रेंज, उच्च fpr नापसंद कटौती (> 20%) के साथ रोगियों के लिए recomm हैंसमाप्त हो गया. इसके विपरीत, के लिए सीमित चिकित्सकीय विकल्प के साथ भारी पूर्व इलाज रोगियों, कम fpr नापसंद कटौती (> 5%) इस्तेमाल किया जा सकता है. चिकित्सा मार्गदर्शन के इस तरह वर्तमान NRTIs, NNRTIs, पीआईएस, और INIS, जहां आंशिक रूप से सक्रिय दवाओं कम चिकित्सीय विकल्पों के साथ रोगियों के लिए इलाज में शामिल किया जा सकता है के लिए परीक्षण प्रतिरोध से चल रही है. इसके अलावा, नैदानिक प्रासंगिक genotypically निर्देशित चिकित्सा परिवर्तन की बढ़ती संख्या के साथ fpr नापसंद कटौती लगातार bioinformaticians virologists, और चिकित्सकों के एक पैनल द्वारा समायोजित किया जा रहा है.
Genotypic tropism परीक्षण की एक अन्य महत्वपूर्ण लाभ बहुत कम है या भी undetectable वायरल लोड (वीएल) के साथ चिकित्सीय नमूनों का विश्लेषण करने की संभावना है. इस मामले में, जब प्लाज्मा आरएनए amplifiable नहीं है, proviral डीएनए और अनुक्रम किया जा सकता है विश्वसनीय 9,12 भविष्यवाणियों के लिए प्रयोग किया जाता है. ध्यान से, कम या undetectable वायरल लोड के साथ रोगियों की संख्या तेजी से हाल के वर्षों में बढ़ गया है. तिथि करने के लिए, टीrofile परख केवल VL साथ रोगियों <1000 प्रतियां / एमएल से नमूने के विश्लेषण की अनुमति देता है. हालांकि, प्रारंभिक अध्ययनों से पता चला है कि proviral डीएनए भी 13 Trofile द्वारा परीक्षण किया जा adecuate हो सकता है.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों कोरस, MedSys सेल एंट्री, चेन और RESINA परियोजनाओं से वित्त पोषित कर रहे हैं.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| MagNA Pure Compact Nucleic Acid Isolation Kit I | Roche Diagnostics | 04 802 993 001 | |
| MagNA Pure Compact System | Roche Diagnostics | 03731146001 | |
| T3000 Thermocycler | Biometra | 050-723 | |
| One Step RT-PCR Kit | Qiagen | 210215 | |
| HotStarTaq Master Mix Kit | Qiagen | 203445 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Exonuclease I (Exo I) | Fermentas | EN0582 | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Fermentas | EF0651 | |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Applied Biosystems | 4337457 | |
| Sephadex G-50 Superfine | GE Healthcare | 17-0041-01 | |
| ABI Prism 3130 XL capillary sequencer | Applied Biosystems | 3130XL |
References
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