视频率扫描共聚焦显微镜和内窥镜

在实验中使用的特定染料的基础上，分色镜，激光波长和光学过滤器的选择应确定。例如，共焦成像的Alexa Fluor 488染色样本的最佳方式是使用488 nm激光，500纳米长通分色镜，30纳米的带宽的带通镜中心在515 nm处。相比之下，红色染料的Alexa Fluor 647共焦成像会需要一个不同的组件。在本议定书的显微镜是建立可视化，在400 nm处的强烈吸收，并超出450 nm处发出的任何染料。因此，我们选择了一个406 nm的激发激光，和一个425纳米长通分色，以反映激光束。激发荧光基团，可以有选择性地通过选择适当的排放过滤器，可想而知。重要的是整个协议中使用适当的光安装硬件;不当或临时搭建的硬件不会举行对齐以及可以安全隐患。 <P类=“j​​ove_title”> 1。设立谐振振镜镜和中继光学在任何一种共焦扫描系统建设的一个重要的概念是聚焦远心。在远心光学系统，镜头焦距，这种系统的放大倍数是简单地由1焦距的比率定义和相互的间距。这使的光中继系统的放大倍率，因而系统属性，很容易被选择的镜头定义的建设。另一个重要的概念涉及到所谓的“固定”光飞机，也被称为“光圈飞机”。光圈飞机是沿光路的光束不接受任何一种横向运动的位置。在这种显微镜的设计，有三个重要的光圈面：第一次和第二次的扫描镜，回物镜口径。为了达到最佳的光束SCA在焦平面的客观nning，光束进入物镜后孔径必须是静止的，只在角席卷。为了创建这个固定的，掠角的飞机，我们需要的地方第一次和第二次扫描镜共轭，远心飞机的客观背光圈。为继电器这些固定飞机（ 图2）之间的角度光束扫描的反射镜和物镜之间的镜头。扫描镜安装在两个扫描galvos，其中每一个负责扫描成像平面（X和Y）方向。为了获得所需要的线，视频率成像扫描速度，高频率的谐振振镜扫描X轴（又称“快”轴）。这些galvos利用一个敏感的，闭环反馈电路，以创建一个正弦扫描模式，能够工作在非常高的频率，我们选择了8千赫振镜此构建。 设置光纤准直器和光学挂载大致转向束使用，它在一条直线上传播水平和垂直方向的调整螺丝。现在，虹膜，并放置在光纤准直前，调整光圈的光束传递干净通过虹膜中心的垂直高度。下一步，将虹膜远离沿光束路径的准直仪和观察，如果光束仍然通过虹膜中心的旅行。如果不是，调整使用两个调整螺钉虹膜上的光束位置。 将约镜子的中心位置的激光束的光束路径上的分色镜。夹紧镜表之前，旋转镜架，以反映在大约90度的光束，大致调整反射，使反射的激光束的垂直高度不改变。 将一个安装谐振振镜镜的激光束路径，采取车e以确保激光束在镜面的水平中心的确切位置。在这个协议中，谐振振镜镜expoxied直接镜子支架。旋转镜坐骑，以反映在90度角的激光束。大致调整脱镜反射来维持相同的激光束垂直高度。 以直接光线，在任何一个给定的的方向，必须定义所定义的两个空间中的点，通过这些射线会旅游。这通常是沿所需的水平和垂直路径放置两个虹膜和操纵的激光束，通过每个光圈的中心。 4个自由度需要调整光束，每个虹膜自由的水平和垂直度。最常见的和直接的方式来实现这些自由度是使用两镜引导，或“步行”的激光束。 采取两个虹膜，并设置其垂直高度在步骤1.1中，使用激光束反射谐振振镜镜作为参考。现在，使用为指导，对眼睛的光学实验电路板的螺丝孔，钳两个虹膜在一条直线下降。 调整分色镜和共振振镜镜引导激光束通过两个虹膜中心。使用路径中的第一个反射镜（分色镜）为中心，第一光圈的光束，然后使用路径中的第二个镜像（谐振振镜镜），第二个光圈中心梁。反复调整这些镜子，直到梁通过两个虹膜对齐，保证了整个谐振振镜镜反射的激光束仍然是从近似镜中心反映。如果光束偏离，调整光纤准直器安装和重复迭代上述步骤。 两个虹膜中心的光束，我们现在将两个中继镜片，将图像我们的第一个固定的，远心计划E（ 即谐振振镜镜）到我们的第二个固定，远心面（ 即 ，标准的高速振镜镜） 。对于这个特殊的显微镜，在第一个继电器的选择的镜头有相同的焦距，“F”，所以在我们的远心系统的两个镜子之间的距离仅仅是4F。为了确保镜片正是在光束路径为中心，用镜头对准技巧。放置在光束路径的第一个镜头，并期待在虹膜光束路径中的下一个镜头的激光束光斑。接下来，垂直调节镜头高度，使梁的垂直中心虹膜中心。最后，调整横梁位置，虹膜中心梁。开展第二个镜头相同的过程。 2。设立的第二次扫描镜和旋转显微镜要找到第二远心面的确切位置，钩谐振振镜其扫描单元，并打开它。使用白色的名片，跟踪通过两个镜头的扫描光束。你会发现在4F从共振的振镜，激光束会出现完全固定的大致距离的远心面。标记此实验电路板的位置。 在这个确切的远心平面位置的标准扫描振镜镜的位置，并调整镜子的高度和位置，在远心面束撞击的扫描镜的确切中心。功率可达镜控制硬件和扫描镜输入0伏特的电压，使镜落户在此过程中的中立立场是至关重要的。仔细调整镜子的角度直接束垂直，然后轻轻地拧紧位置的镜子。 由于我们正在建设一个堂堂正正的显微镜，我们现在将附加安装支架采用90度90度角的第二个面包板。确保关闭激光和扫描电子，断开的光纤，并在此过程中断开扫描镜。为了使其他容易对齐，一旦括号中的地方狂奔，仔细旋转整个显微镜，使新的面包板，现在是平躺着。使用钳修复的实验电路板的工作表面。原垂直设置的其余部分可以方便地进行，在平面上的面包板。 3。设置扫描，管，物镜下一步，我们将成立第二组中继镜片，正式称为“扫描镜头”和“管镜头”。重要的是要选择正确的组合镜头，以实现正确的目标重点倍率和优化最终的图像分辨率。首先，以达到最大的任何给定的物镜数值孔径（NA）的，激光束的攻击目标背面必须填写的回光圈完全，只有这样，物镜能够建立严格的重点。物镜回孔径范围;选择一个镜头倍率略有溢流回光圈选定目标。其次，为了实现正确的放大倍率，物镜必须匹配与管镜头焦距为它设计的。不幸的是，不同的显微镜物镜制造商选择使用不同的管镜头焦距，所以重要的是要建立与聘用的具体目标镜头的正确管透镜显微镜。此外，某些制造商，如蔡司，设计管镜头，以补偿为特定的色差，其匹配的目标，例如，使用不当的目标管镜头对，实际上将引进新的畸变，本来不存在的。我们通常喜欢奥林巴斯的目标，所有半音的补偿是次演出Ë目标本身，目标/管镜头配对更容易。虽然在显微镜下仍然可以工作，如果不匹配的目标和管镜头，实际显微镜的放大倍率可能会不匹配上市物镜放大倍率。对于这个特殊的显微镜建设，最优回光圈大小被确定为4毫米，需要1:4放大倍率的扫描镜头和管镜头之间的。此自定义显微镜的建立，我们将使用一个镜头长度为75毫米的扫描和管300毫米镜头长度。 由于之间的第二次扫描镜和目标集中的总距离是大的，这种显微镜段建设将首先布局的引导束物镜所需的镜子。广场的第一大，2“（50毫米）直径镜接近的实验电路板的边缘，和旋转镜坐骑反映大约90度的激光束。粗略调整脱镜反射保持在同一垂直BEA米的高度。将其他相反的方向，指示在90度角向下束的实验电路板边缘的“镜子。使用调整螺丝，以确保不改变光束的垂直高度。设置两个虹膜，在步骤1.4，并调整两个中心的指示步骤1.5虹膜束镜。 仍实行虹膜，放置在光束路径的扫描镜头，并调整其水平和垂直位置，以中心第一虹膜激光光斑。在距离为75毫米+ 300毫米镜头（两国镜子），小心地大2“管镜头，其水平和垂直位置调整的第一个虹膜中心梁。为了在未来保持一致的，它是有用的，留在原地这些虹膜的，对于这种应用，可以与一个适当大小的洞的名片粘到一个立场，在光束路径中。 随着所有的反射镜和透镜现在的地方，开始扫描振镜镜谐振和标准的扫描镜。在此建立，标准的扫描镜将最终被通过一个定制的控制电路，如在图3中描述的谐振镜扫描速度同步，这提供了卓越的垂直和水平同步。然而，对齐的目的，许多成像应用，可以很容易地被扫描镜子使用函数发生器的锯齿图案。使用名片，定位在300毫米管镜头后的激光束。虽然束扫描显微镜的水平和垂直方向的其他地方，梁应完全固定这个位置附近。这是回孔径的物镜将被放置。水平和垂直的固定飞机如果不重合在同一平面上沿光束路径，仔细地松开，沿光路转换管镜头，以确保两个飞机重叠尽可能密切。中心管镜头的垂直和水平位置和安全钳位置。 放置在光束路径的物镜，一定要客观的镜头光圈尽可能接近固定平面位置。真实客观的回光圈，实际上并不可能总是位于身体背部开放由于不同制造商的设计选择的目标。因此，最好始终与制造商的检查，以确定真正的背面光圈的位置。 设立了样品台，确保翻译的坐骑，将允许Z轴移动可全方位移动，而不进入物镜安装运行。 4。设置和调整共聚焦针孔探测器断开所有电源和光纤，旋转显微镜大会，再次在于持有共振的实验电路板NAnt的扫描镜。面包板牢固地夹紧在地方，然后重新连接光纤准直仪，并重新连接galvos和控制电缆。一如以往，地方上的控制电压0伏驾驶标准的扫描振镜。 在样品台上，放置名片或一个目标集中在明亮的染料，体积小，夹在两个盖玻片之间。染料的选择将取决于激光和选定的分色，在这种情况下，我们将使用从一个白色的名片的荧光发射，对准焦检测系统。量子点也可以用于对齐的目的是有用的，因为他们是光明的，并没有光漂白。其他的替代品包括荧光珠和/或面料样品暴露于颜色/洗衣增白剂，这两种荧光明亮。打开激光源，并把显微镜使用的翻译阶段的重点范例。一旦重点，从样品产生的荧光可见背后吨他的分色镜，如下一步中所述。最大限度地提高激光功率，以使尽可能明亮的荧光。 使用名片，跟踪通过物镜和回通过扫描系统的分色镜样品的荧光发射。分色镜将发射的荧光发射，同时反映了激光束;找到这个分色镜的另一边的荧光信号。现在，将背后的分色镜的一面镜子，用它来反映在90度角的排放。在步骤1.1，并以一个光圈，使用镜子，沿直实验电路板平行并尽可能直接荧光束。这一步可能是最好的在昏暗的灯光下进行。 如在图2中所述的共焦针孔单位。我们发现，从ThorLabs空间滤波器笼贴装这一任务的理想。重要的是要选择一个合适的pinholE尺寸，以确保共聚焦系统，达到不牺牲太多信号的最佳分辨率。此自定义显微镜，一个针孔大小为100μm被选中。广场空间与荧光光束路径过滤装置，照顾中心首次聚焦镜头卡口上的荧光发射光束。安装后的单位（也可以用显微镜目标）一个短焦距镜头，滑动Z -平移安装，可观察针孔表面上，直到一个明确的重点。确保整个单元是面向荧光束沿确切的直线。夹紧装置的实验电路板。 即使在黑暗的房间环境光水平相比，大部分样本的排放是薄弱。因此至关重要的是足够的屏蔽/光莫名其妙被用于保护从杂散光污染排放路径。此外，环境光水平高过载和损坏许多光电倍增管，特别是那些没有current保护。读者，因此强烈呼吁使用镜头管括发射光束路径;正确屏蔽系统，像这里展示的，是能够在室内光线与小无杂散光污染。 现在，使用翻译舞台上的调节旋钮，系统将共焦针孔找到点通过针孔的荧光信号最大化。这一立场是最容易识别，通过迭代调整两轴执行通过针孔贴装表面的二维搜索。一旦发现信号最大化的立场是，地方上笼安装后的针孔准直透镜。查找荧光发射，通过共焦单位使用名片，幻灯片，直到发出的荧光信号尽可能平行准直透镜沿职位。一旦光束准直，请务必放置在光束路径的适当的过滤器中的一个镜头浴盆E. 设置的光电倍增管（PMT）大会。放置在荧光发射光束路径的50毫米焦距镜头，并找到其联络点使用的一张名片。标记此实验电路板的位置。现在，关闭激光完全 – 这一点很重要，因为流浪或衰减的激光光可以永久损伤大多数光电倍增管。的位置，以便其活动区域是位于标记的焦点尽可能接近的光电倍增管。连接PMT大会聚焦镜头，使用可调镜头管，并仔细包装所有外露的光束路径周围的黑暗带针孔。 打开激光，但一定要保持其功耗极低，隐约可见荧光发射。打开光电倍增管，仔细阅读了其在示波器上的电压控制电压增加。一个光电倍增管产生信号通过一系列电子乘以阶段;如果光入射光水平过高，可管不可逆的损坏。 光电倍增管与限流电路，因此强烈建议，特别是对那些没有工作过这种探测器的用户 。 增加PMT控制电压，直到一个穗状的读出和/或直流偏移可以在示波器屏幕上看到，大多数光电倍增管，此信号将是负面的相对地面。确认该信号确实把激光功率，以观察到的信号损失，从荧光出现。 最后，反复校准示波器的最大信号首先操纵聚焦透镜Z -位置，然后调整YZ翻译阶段针孔。 视频率显微镜硬件就完成了！现在挂钩的镜子，自定义控制板和电脑图 3图解。如上所述，这是推荐使用的成像系统，首先看到一个已知大小的标准，找到最佳分辨率显微镜，并计算像素高分辨率成像系统的恒定。有许多大小的标准，可用于如与知名的信件大小，荧光或反光空军的目标，和荧光微球白色名片，。 5。共焦扫描内窥镜系统准备建立在此我们使用一个连贯的图像纤维，其中包括成千上万的纤芯束，这样的安排，使图像传输通过光纤和容易重建和/或扩大在另一端（ 图4） 。内窥镜建设中使用相干纤维束两端打磨，使其成为一个所谓的“接触模式”microendoscope。在聚焦图像，因此只能形成时microendoscope提示是密切联系带来了一个对象。在这个伪焦安排，扫描显微镜的行动重点一​​架F激光iber核心的时间，而共焦针孔确保没有从周围的纤维焦是允许通过的探测器。对于不同的成像应用，可以增加一组镜片上的远端尖朝前，长途荧光成像允许。显微光学镜头，以及梯度折射率（GRIN）镜片，可以很容易地适应这种使用，并可以贴在远端的纤维提示使用光学质量胶水。 要成立的内窥镜成像系统，小心取出样品阶段，它取代光纤控股阶段（ 图5）。浸弱解的染料在纤维束的一端，使荧光发射是产生均匀分布在所有的纤芯。打开扫描系统，并调整纤维的持有人带来的纤维束的焦点（近端，或结束最近的显微镜光学）的另一端。首先，使用换算调整SCR中心EWS纤维在扫描领域。现在，看看从近端纤维尖端，而荧光光谱图像扫描。当完成microendoscope表面是在焦平面的客观，所有纤芯的荧光发射将尽可能一致。使用角度调整旋钮调整纤维的表面，使所有纤芯均匀明亮。在这次调整中，它可能会重新调整翻译的位置，重新中心的扫描领域中的纤维是必要的。通过这些调整迭代，直到整个纤维的提示是正确的焦点。 在使用microendoscope，使用HPLC级甲醇稍微浸湿的镜头清洁纸轻轻擦拭远端提示。像以前一样，使用一个已知大小的标准来衡量和计算microendoscope成像系统的分辨率。 6。代表性的成果： 图6显示了一个完成UPR的例子配置为内窥镜的飞行共聚焦扫描显微镜。束激光和排放已制定为指导，对眼睛。光纤挂载认为在内窥镜操作的地方的形象纤维。这种纤维支架可以很容易地取代作为一个堂堂正正的显微镜平台使用与XY或XYZ翻译阶段。 ThorLabs部分PT3（XYZ公司翻译）或两个叠PT1阶段（XY翻译）的工作，以及为这个应用程序，如ThorLabs部分AP90直角支架。 一个视频的速率采集卡卡是用来产生输入信号的图像。图7显示了一个有代表性的测试图像，采取一个小写的“M”印在白电业务卡使用视频率显微镜扫描系统。漂白白皮书包含很高兴的紫外线和蓝光，在黑暗的字母“M”背后明亮的背景荧光团。被选为515 nm处的排放过滤器收集荧光。 A M可以观察到无机的图像失真，尤其是靠近外侧边缘的图像帧。从8kHz的gavlo镜正弦扫描模式，这种扭曲的结果将在下面详细讨论。 图1展示共聚焦显微镜的工作原理图。转送回原产射线从客观的焦点是通过该系统，并通过共聚焦针孔（红色）为重点。霞光原产以上（蓝色）或低于（绿色）的目标重点不出现从平行的目标，并因此不能有效地通过共聚焦针孔传输。 图2通过束扫描系统中所有的光路图显示。扫描镜坐在飞机远心与STAtionary，客观回光圈平面。双镜片之间的固定飞机的行为继电器扫描光束。前两个继电器镜片有平等的焦段，形成了一个1:1的望远镜。 ，正式称为扫描镜头和管镜头，镜片的第二对不等于焦距，并经常作为扩大束望远镜，以确保目标后孔径过满。从样品发出的光通过扫描系统，是通过分色镜通过。短焦镜头主要通过共聚焦针孔，然后由一个透镜准直发射光。最后一个镜头聚焦到光电倍增管焦过滤排放。 点击这里查看一个全尺寸的版本，这个形象 。 <img src="/files/ftp_upload/3252/3252fig3b.jpg" aLT =“图3b”/> 图3：（一）扫描电子设置的概览图。显微镜的整体参考信号和时基是“同步”快轴谐振振镜镜，产生一个TTL脉冲在每个扫描行的末尾（也就是说 ，当振镜已经完成一个扫描周期）的TTL输出。这提供了H -同步信号采集卡卡。也连接到V型同步控制电路板，逐步增加其输出电压在每个H同步脉冲产生锯齿波驱动慢扫描轴振镜的同步输出。一旦所有行已扫描，V型同步板复位锯齿波形和产生一个TTL脉冲，采集卡的V型同步信号。最后输入的采集卡的卡是从光电倍增管（请注意，许多光电倍增管产生负输出电压的模拟信号，确保您的电路设计d选择相应硬件）。视频率图像生成并显示在Matrox的采集卡软件。 （二）控制电路范例。在这个设计中，每个H同步脉冲电压是补充说：“”/集成运放集成产生锯齿波的斜坡;脉冲随之而来的TTL计数器阶段计算。当所需的行数已达到（ 即光栅扫描完成时），计数器产生一个低电平有效的“开展”脉冲，驱动器施密特触发器产生一个复位脉冲积分。这将重置计数器和运算放大器的集成商，准备进行下一个周期的电路。适当的元件选择，使得这条赛道，广泛适用于各种栅格尺寸。这是唯一一个实现;许多其他的实现是可能的，可能在某些情况下的首选。此外，该电路是专为使用与Matrox的采集卡卡S，检测和自动正确的图像相。如果电路是用于与其他framegrabbers，相位校正电路或软件可能需要点击这里查看全尺寸版本的这个图片。 图4通过一个连贯的纤维束的图像传输。在这个原理，捆绑两侧的镜头扩展到纤维束的输入，以及扩大对纤维束输出的图像投射影像。 图5安装在一个5轴装入一个纤维束的例子。小1“直径铝块很无聊，所以可以插入图像的纤维束。 BOT铝块内纤维是epoxiedh的顶部和底部块稳定。 图6：附加microendoscope完成显微系统的图像。为了更好地可视化光线的路径，激发光束路径是蓝色绘制，而分色镜后的发射光束路径绘制一条红线。 图7。视频率共焦扫描显微系统生成的示例图像。一个黑暗的小写字母“M”出现一个白色的名片上明亮的荧光背景。