التصوير التصاق كريات بيضاء لبطانة الأوعية الدموية في الضغط داخل اللمعة السامية
Summary
هذا هو أسلوب لتصور التصاق الكريات البيض في بطانة الأوعية في الضغط المقطوع. هذه التقنية تتيح دراسة التصاق الأوعية الدموية تحت تدفق القص مع اختلاف الضغوط داخل اللمعة ما يصل الى 200 ملم زئبقي وبالتالي تقليد جي الظروف المرضية في جسم المريض من ارتفاع ضغط الدم.
Abstract
Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.
Protocol
Discussion
هذا هو أسلوب لدراسة تعديل لالتصاق الكريات البيض في بطانة الأوعية الدموية سليمة في ظل ظروف الضغط معزولة في الوقت الحقيقي. نضح من الغرفة وحدها السفينة تمكن من التحقق من صحة السريع الموالية للالتهابات سلالات من الفئران الكبيرة والسفن الفئران. تمكين التلاعب الضغط يسمح لوحظ من التفاعلات الحيوية الخلية المنخفض لضغوط داخل اللمعة عالية جدا ، وبالتالي أفضل تقليد جي الظروف الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض. ويمكن أيضا للسفن القطر يقاس باستخدام خلايا كافية تصوير برنامج ويمكن تحديد تدفق القص وبالتالي معدل وبالتالي التلاعب.
مع قدرات myograph والخمسين ، التدخلات الدوائية وضعها في حمام تضيف بعدا آخر للظروف تجريبية محتملة مع هذا النموذج من الدراسات تمكين المسارات الآلية والإشارات. في حين لا يستطيع المحافظة على البطانية خلال التلاعب وأكد أن الضغوط ، يمكن أن تتم الاستجابة لأدن تشافيز وPE نضح آخر 9.
وتجدر الإشارة إلى أن هذا يدل على الإعداد آثار الضغط داخل اللمعة على الخلية الى خلية التفاعلات لا آثار تدفق الدم الانقباضي أو نابض ولا الضغوط الانبساطي. وعلاوة على ذلك ، في حين لوحظت تغييرات الضغط الحاد على التصاق الكريات البيض ، ويمكن استخدام هذا الإعداد أيضا أن ننظر إلى آثار الضغط المزمن (أي زيادة مرات حضانة واستخدام الحيوانات الضغوط المزمنة نموذجا). وأظهرت سبراغ الشرايين السباتية داولي المشتركة في هذه المجموعة لكنها يمكن أن تستخدم السلالات والأنواع الأخرى مع إجراء التعديلات المناسبة لحجم قنية. في الواقع ، فمن المهم أن نلاحظ أن العمر والوزن من الحيوانات تؤثر على حجم السفينة ، وبالتالي أن مجموعة يحتاج إلى ما يقارب تكون فردية عن كل سفينة. يمكن تشريح وثيق ودقيق لتحسين التصور النسيج الضام من الكريات البيض كثيرا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة في جزء من برنامج الحكومة OIS الفيكتوري ، والوطني للصحة ومجلس البحوث الطبية من برنامج المنح والمشاريع أستراليا (JPF شين الغبار) ، والمنح الدراسية للدراسات العليا (D ميشل).
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Microscope | Carl Zeiss, Inc | SteREO Discovery V.20 | |
| PHD 2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
| Digital Camera and Controller | Hamamatsu ORCA-ER | C4742-95 | |
| Fluorescence Illumination System | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
| Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH/1/SH | |
| Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS – 200 | |
| Perfusion Pressure Monitor | Living Systems Instrumentation | PM – 4 | |
| 2 x Pressure Transducer | Living Systems Instrumentation | PT – F | |
| Temperature Controller | Living Systems Instrumentation | TC-01 | |
| Peristaltic Pump | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
| VybrantDil cell-labelling solution | Invitrogen | V-22885 | Use 1:1000 |
References
- Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
- Szczech, L. A. Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension. Circulation. 121, 2183-2191 .
- Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke. Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).
- Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. JAMA. 275, 1557-1562 (1996).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Riou, S. High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall. Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).
- Ley, K., Gaehtgens, P. Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res. 69, 1034-1041 (1991).
- Bernhagen, J. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13, 587-596 (2007).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Eberth, J. F. Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling. J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).
- Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator. J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).
