Otolog Endotelyal progenitör Hücre-Yayımlama Teknoloji ve Büyük Hayvan Modeli Kardiyovasküler Cihazlar için Biyouyumluluk Testleri

1. Endotel progenitör hücre izolasyonu EPC numaralı seribaşı tüp implantasyonu otuz gün önce, 15 ml antikoagülan sitrat dekstroz çözeltisi ile, 60 ml şırınga hazırlamak ve EPC, periferik domuz kandan izolasyonu için 3-yollu vanasını ile güvenli. 24 saat önce kan beraberlik, Astar iki Tip 1 sıçan kolajen (50 mg / ml 0,02 N asetik asit çözeltisi içinde çözünmüş) 4 ile 12 kuyucuğu. Ulusal Enstitüsü Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi doğrultusunda ve sadece nezaret Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayından sonra, tüm hayvan bakımı ve deney gerçekleştirin. Bir kadın Yorkshire Acepromazine sakinleştirmek ile domuz (45 kg) (1.1 mg / kg) ve Ketamin (22 mg / kg), 19 G kelebek iğne ile intramüsküler. Endotrakeal tüp (30 cm uzunluğunda, 8 mm ID) ile domuz entübe ve İsofluranın (maske ile gelgit hacmi% 4.5) ile domuz uyutmak. Oksijen satürasyonu, kalp hızı ve sıcaklığı ölçerek işlem sırasında domuz izleyin. Otomatik bir ısıtılmış ameliyat masasında ve ısıtma battaniyesi kullanarak ve infüze edilen sıvı ısınmanın termoregülasyon koruyun. Domuz ameliyat masasına yatar pozisyonda yerleştirin caudolaterally arka bacaklarda, güvenli ve DuraPrep sterilizasyon takip Klorheksidin ile temizleyin. Daha sonra pelvik bölgede draping devam edin. Femoral ven içine palpabl femoral nabız (vastus medialis ve gracilis kası lateral medial) sadece medial 5 F mikro-introducer kiti, 21 G x 7 cm iğne takın ve Seldinger tekniği kullanılarak damar cannulate. Intravasküler kateter, hazırlanan 60 ml şırınga bağlayın ve 45 ml kan çekmek. Hemostaz (5 dk) elde etmek için damar ponksiyonu sitesi üzerinde baskı tutun, anestezi durdurma ve domuz kurtarmak. Hayvan tam iyileşme kadar takip ve kendi kafesine döndü. Kan çözüm Hank tamponlu tuz solüsyonu ile 1:1 (CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4 olmadan) ve eşit miktarda iyi tanımlanmış katmanlar oluşturmak için Histopaque katman sulandırınız. Santrifüj (30 dk, 740 g, düşük bir kırılma ayarı) ve toplamak mononükleer hücre (ÇUŞ) katmanı. Süspanse edin ve Dulbecco'nun Fosfat yıkama ÇUŞ x 3 tam büyüme orta iki 12-iyi plakaları (EBM-2 orta% 2 Domuz Serum (PS) ve EGM-2 ile içine kaplama önce Tuzlu (DPBS) (10 dak, 515 gr) Tamponlu SingleQuots) 37 ° ° C,% 5 CO 2. Yavaş yavaş daha sonra ilk 7 gün, her gün her 24 saatte bir, orta değiştirin. Ortalama bir süre sonra EPC koloniler tespit 7 gün (Şekil 2). 12-iyi bir yüzey alanı ¼ kapağı bir kez kültür EPC genişletin. Flow sitometri ile CD14 CD31 ve yokluğu, CD45 yüzey belirteçlerinin varlığı için test EPC kimlik onaylayın. Diğer testleri yapılabilir 4. akışına maruz kaldıktan sonra, hücre morfolojisi ve nitrik oksit III aktivite içerir . 2. Titanyum boru montaj HHS dilme 72 dişlere sahip boyuna Bölüm 3 eşit 120 derecelik birimleri (4,5 cm uzunluğunda) içine bir Ti borusu dikey freze testere mili tarafından yerinde tutulur gördüm. 300 RPM çalıştırın ve kesim esnasında her zaman dokunun Magic Kesme Yağı (Şekil 3) ile doymuş kesim alanı tutmak. Lehçe bir tezgah değirmeni ve bir Scotch-Brite metal işleme simidi ile iç yüzeyi. Sonra daha da pürüzsüz ve yüzey 3M zımpara bezle elle lehçe görünür bir çukurları kaldırmak için. Aqua regia oldukça aşındırıcı ve su altında 5 dakika, birkaç litre su 10 ile durulama ardından aqua regia (01:03 konsantre hidroklorik asit ve konsantre nitrik asit), Egzersiz son derece dikkatli takip Ti adet, Alconox sabun solüsyonu ile temizleyin Potansiyel olarak patlayıcı! Sonikasyon Ti bölümler x 16 dk Alconox sabun çözeltisi, deiyonize su x 30 yükselişi ve deiyonize su x 16 dk tekrar sonikasyon. Laminer akış kaput kurumasını bekleyin. 4.5 cm uzunluğunda ve 2.4 ortalama temiz Kes PVC ısı küçültmek boru. 3 temizlenir Ti bölümleri destekleyici bir mandrel (alüminyum, 8,5 mm OD işlendi) ve Ti bölümleri etrafında PVC ısı shrink boru (Şekil 4) kol üzerine yerleştirmek için cımbız kullanın. Eşit Ti bölümleri birbirine sıkıca sarın mandrel açarken bir ısı tabancası ile şirink tüplerde. 3. Seeding cihaz ve montaj Silikon tüp, 2,5 cm ve 3,5 cm uzunluğunda kesin. Bölüm 5 cc plastik 0.8 ml şırınga ve döner sonu ile 'başlık' tutmak. 2 x silikon bölümleri, şırınga 'başlık' ve 2.4 'de açıklandığı gibi bir döner kap sonication iyice temizleyin. Mikolojik monte Ti tüpün her iki ucunda, 2.5 silikon tüp ekle5 mm PVC boru üzerinde ding. Abuts Ti borusu (Şekil 5), böylece, kısa bir silikon tüp içine şırınga 'başlık' ucu yerleştirin. Seal Tyvek çantası ve etilen oksit gazı (18 saat 55 ° C) ile sterilize bir döner kap Ti boru montaj bitirdi. Senkron bir zamanlama motor (10 RPH) pleksiglas bir platform üzerine monte edin ve bir şırınga tutucu (alüminyumun işlenmiş, 5 cc şırınga uyan) (Şekil 6) aks bağlamak. 4. EPC-Ti tüp iç yüzeyi tohumlama 1 altında izole olarak EPC genişletin. T-75 şişeler 3 konfluent (veya en az 9 x 10 6 hücre). Ameliyat günü, uzun vadeli boya (PKH26) 11 ile floresan etiket hücreleri. Iki kez serum serbest orta kültürlü EPC durulama başlayın. Dikkat etiketleme sırasında ve sonrasında hücreleri korumak için ışık maruz kalma sınırı. 4 dakika boyunca oda sıcaklığında Dilüent C 4 mcM PKH26 (boya solüsyonu) ile hücreleri örtün. Eşit miktarda boya çözüm domuz serumu ekleyerek reaksiyon etiketleme durdurun. Bir dakika sonra, tam büyüme ortamı ile birlikte çözüm 01:01 sulandırmak. Sıvı aspire edin ve tam besi hücreleri x 3 durulayın. (CaCl 2, MgCl 2 olmadan) iki kez DPBS EPC yıkayın. 3 dakika 37 tripsin ve inkübe hücreleri ° C Kapak ve ışık mikroskobu altında dekolmanı onaylamak. Kullanılan tripsin çift ses tripsin Nötralizasyon Çözüm ekleyin. Pipetleme tarafından tek bir tüp ve karışımı içine hücre çözümleri birleştirin. 10 ul hücre çözüm saymak için bir hemasitometre her tarafına ekleyin. Santrifüj hücre çözümü (1500 RPH, 5 dk.) 2 hücreleri ve tekrar süspansiyon pelet sayısı 2.5 x 10 6 EPC / ml serum serbest ortamda. Boru montaj 4,5 ml doldurmak için minimum hacim unutmayın. Steril alan için biyolojik kaput steril havlu yerleştirin. Açık gaz steril steril sahaya Ti boru montaj ve ilave 5 cc şırınga. Steril eldiven, 5 cc şırınga pistonu kaldırmak ve daha sonra kullanmak üzere alan üzerinde tutmak. Bu şırınga sabitleyiniz döner kap. Pipetleyin 4.5 – 4.9 altında açık şırınga varil içine 5 ml EPC süspansiyon. Piston geri şırınga açık ucunu güvenli bir şekilde yerleştirin. Yukarı kap şırınga tutun ve kapağı çıkarın. Ti tüp içinde ilerleme yok; rahatça kadar ilk döner sonuna Ti boru montaj açık silikon tüp içine şırınga takın. Avans şırınga pistonu yavaş yavaş hücre çözümü kabarcıklar sistemden kaldırma ', baş parça kesme şırınga üst ulaşana kadar. Luer kapağı ile kapatın ve tüm montaj bandı ile sızdırmazlık, açık ucunu steril kılıf içine yerleştirin. Tüm bu meclis 3.7 işlenmiş şırınga tutucunun içine yerleştirin. 37 inkübatörde Yeri ° C ve tohumlama odasının bu Ti tüp kısmı su seviye göstergesi (Şekil 6) kullanarak, böylece bir platform ayarlayın. Ti boru montaj implantasyon 30 dakika önce döndürmek için izin verin. 5. Domuz vena kavaya Ti tüp implantasyonu Ameliyat öncesinde yirmi dört saat, Fentanil bir patch (yama yer x 72 saat 100 mg / saat transdermal) ile domuz premedicate (EPC izole edildiği). Domuz NPO gecede tutun ve ameliyat günü (5 mg / kg, IM) ve 7 gün süreyle antibiyotik profilaksisi olarak her 24 saatte bir, aşağıdaki preoperatif Baytril (Enrofloxacin) yönetmek. Sakinleştirmek, entübe ve 1.3 altında açıklandığı gibi domuz uyutmak (10 -15 ml / kg tidal volüm) ve ameliyathane masaya yatar pozisyonda domuz güvenli. Oksijen satürasyonu, kalp hızı ve sıcaklığı ölçerek işlem sırasında domuz izleyin. Otomatik bir ısıtılmış ameliyat masasında ve ısıtma battaniyesi kullanarak ve infüze edilen sıvı ısınmanın termoregülasyon koruyun. , 18 G IV kateter domuz kulak damar içine yerleştirin ve Vetropolycin göz damlaları ile domuz gözleri korumak. Temiz, hazırlık ve 1.6 olarak domuz karın asmak. Kaudal son meme bezlerinin cranially 2. 2. # 15 neşter bıçak ile orta hat İnsizyon. Elektrokoter ile karın fasya diseksiyonu aşağı taşıyın. Sivrisinek forseps ile periton kaldırın ve Metzenbaum makası ile dikkatlice girin. Mesane Externalize ve 3-O Vicryl çanta-string sütür mesane duvar içine yerleştirin. Onun ortasında bir bıçak kesi yerleştirin ve 16 F Foley kateter yerleştirin. Idrar çıkışı titre intravenöz sıvılar (Laktat Ringers) Yönetici> / = 1 ml / kg / saat ameliyat sırasında. Sonra, ince ve kalın bağırsak ve yeri iki Balfour cerrahi retraktörlere peritoneal kavitenin posterior yönünü ortaya çıkarmak ve inferior vena kava (IVC) tanımlamak için dışa. Dikkatli, keskin ve künt diseksiyon IVC dokusu çevresindeki ücretsiz ve IVC distal bifurkasyon proksimal sağ renal arter damar deri bir kemik. IVC bile çok küçük bir kusur hayvan hızlı kanama ve exsanguination neden olabileceğinden IVC diseksiyonu sırasında son derece dikkatli olun. Implante Ti tüp etrafında kanama olacağı sağlamak için IVC segmentinde tüm yan dalları Arter. Çok dikkatli diseksiyon ve ligasyon gerektiren genellikle büyük iki posterior lomber venler unutmayın. Ayrıca, IVC bifurkasyosunda hemen proksimal, büyük bir lumbar ven genellikle posteromedial tarafında karşılaştı ve ücretsiz ve kelepçe yerleştirme için hazırlık gemi döngüler ile kontrol disseke olmalıdır unutmayın. Ti tüp aynı anda 4 altında belirtildiği gibi tohumlama ile devam edin. 100 USP / kg heparin hemen önce IVC sıkma yönetin. IVC ve lumbar ven distalde 45 derecelik açı cerrahi kelepçeler yerleştirin ve sonra proksimale. Potts makas ile uzantısı takip # 11 neşter bıçak kullanarak proksimal ve distal kelepçeler arasında uzunlamasına veinotomy (4 cm) oluşturun. IVC herhangi bir kan boşaltın ve iç lümen steril DPBS ile yıkayın. Şimdi IVC içine yerleştirin ve EPC numaralı seribaşı Ti borusu (veya çıplak metal kontrolü), kurumasını hücreler önlemek ve hava tahliye DPBS (CaCl 2, MgCl 2) ile doldurun . Veinotomy 4-0 Prolen çalışan sütür ile kapatın ve arka kanama küçük bir miktar ile de hava IVC bir proksimal klemp kaldırmak. Zamanla implant göçü önlemek için PVC boru içine damar duvarına bir 'stay-dikiş' koyun. 2-O Vicryl (sütürlerinin) ile BT iğne ve subkutan alan O-PDS ile fasya kapatın. Zımba ile cilt kapatın. 20 ml kadar kesi boyunca subkutan% 0.25 Marcaine (Bupivakain) Yönetici ve gazlı bez ve Tegaderm yara kapsayacak. Subkutan olarak ağrı için gerekli Flunixin (2.2 mg / kg S 24 saat) ve Oxymorphone (4 saat 0.15 mg / kg 'Q 3) vermek. Anestezi durdurun, uyanık kadar domuz izlemek ve kafes dönmek. Sıkıntı / ağrı, ayakta durma ve ambulasyon, dışkı ve idrar çıkışına ve ten rengi normal perfüzyon gösteren işaretleri için günde iki kez domuz izleyin. 6. Ti tüp, kaçırmanın 3 hafta sonra, oturaklı, entübe ve 1.3 'de açıklandığı gibi domuz uyutmak – 1.4. 5.8 – 5.5 'de açıklandığı gibi bir laparotomi ile devam edin. Ancak in situ sert Ti tüp palpe skarlasma implant yeri gizlemek unutmayın. 5.9 de açıklandığı gibi IVC teşrih – 5.11 ve Ti tüp ağır makas ile çevredeki IVC ile en-blok eksplant. Euthasol ötenazi çözüm (390 mg / ml pentobarbital Sodyum ve 50 mg / ml Fenitoin Sodyum 1 ml / 10 lbs) ile hayvan Euthanize. 7. Fiksasyon ve görüntüleme Ti iç yüzey DPBS çözüm Ti tüp ile ven segmenti eksize durulayın ve yüksek çözünürlüklü bir dijital kamera (Şekil 7) ile lümen (patent veya tıkalı) fotoğraf. Ardından, 15 dakika en az% 3.7 paraformaldehid dalma örnek düzeltmek. DPBS çözümü numune durulayın. Çok dikkatli bir şekilde çevredeki ven ve Ti borusu açmak için PVC boru insizyon. Floresan kırmızı / turuncu renk (Şekil 8A) PKH26-etiketli EPC görselleştirmek için 550 nm dalgaboyu / ışık kaynağı ve görüntü altında objektif bakan iç yüzeyleri ile mikroskop altında 3 bölümden yerleştirin. İsterseniz, hücreler (örneğin, Platelet Endotel Hücre Adezyon Marker (PECAM hücre kenarlıkları (Şekil 8B), çekirdekleri görselleştirmek için DAPI leke vb görselleştirmek için)-leke) daha da lekeli olabilir. 8. Temsilcisi sonuçları: Bu protokolün uygulanması sonrasında, doktorlar ve bilim adamları, büyük bir hayvan modeli otolog kan endotel progenitör hücreler ile katı tüp yapıları endothelialize mümkün. Şekil 2 yöntemi ile izole EPC arnavut kaldırımlı morfolojisi ile yaklaşık 7 gün sonra koloniler olarak görünür kültürü. Şekil 5 ve 6 gösterildiği tohumlama cihazı, steril koşullar 9 altında tüp iç yüzeyi düzgün kapsama EPC süspansiyon ve sonuçları ile dolu Ti tüpler yavaş dönüşü sağlar . Bizim implantasyon cerrahisinde büyük bir hayvan modelinde tromboz, Ti gibi Biyomalzemelerin eğilimi, test etmek için izin verir. Biz domuz bu yordamı iyi tolere olduğunu ve bu implantasyon sadece az kan kaybı ve EPC katman kesinti olmadan elde edilebilir bulundu. Ayrıca, bizim EPC çizgili tüp inferior vena kava protrombotik düşük kesme ortamda bile patent kalır ise çıplak bir Ti tüp tamamen tıkar ki t "> Şekil 7 göstermektedir. floresan etiketli konfluent tabakası hücrelerinin varlığını teyit Bu yöntemin başarı olarak Şekil 8'de gösterilmiştir. Şekil 1 otolog endotelyal progenitör hücre (EPC) tohumlama deneyi şematik. İlk olarak, periferik kan domuz çizilir. Sonra, EPC kandan izole ve kültür genişledi. EPC sonra cerrahi hücreler izole edildiği aynı domuz inferior vena kava içine implante bir titanyum (Ti) tüp cihaz, sonra satır için kullanılır. Şekil 2 kültür EPC, izolasyon prosedürü izleyerek yaklaşık 7 gün (Görüntüleme kamera ve QCapture yazılım ters bir Leica DMIL mikroskobu ile görüntülenmiş) Temsilcisi koloni. Montajdan önce Şekil 3 Ti tüp bölümlerini. Ti boru boyuna 3 eşit bölüme kesme ve daha sonra 4,5 cm uzunlukta kesilir. Ti bölümlerde iç yüzeyleri görünür çukurları kaldırmak için bir tezgah taşlama ve zımpara bezi kullanarak parlatılır. Şekil 4 PVC ısıyla daralan boru (mavi) ve ısı tabancası ile Ti tüp bölümlerini Meclisi. Ti bölümleri, Ti bölümleri uzanır ve Ti tüp iç çapı boyutları ile eşleşen bir işlenmiş alüminyum mandrel desteklenmektedir. Şekil 5, tüm bileşenleri gösteren Titanyum tüp tertibatı, döner kapağı, şırınga 'başlık' silikon tüp, ve Ti borusu, PVC wrap (mavi ). Meclis cerrahi kullanım için sterilizasyon için önce birlikte alınır. Şekil 6, motor, platformu gösteren kuvöz içinde Ti tüp tohumlama kurulum, işlenmiş alüminyum şırınga tutucu, Ti boru montaj ve 5 cc şırınga . Not: Montaj görselleştirme amaçlı steril koruyucu kılıf olarak gösterilir. Şekil 7 implantasyon cerrahisi Temsilcisi brüt domuz inferior vena kava (IVC) implantasyon sonrası (A) kontrolü çıplak metal Ti tüp End görünümü. Tüp lümen sağlam bir pıhtı ile tamamen tıkalı (B) EPC numaralı seribaşı Ti tüp sonu görünümü, implantasyon sonrası . Tüp lümen tamamen patent ve net. Kontrolü (C) Dissected görünümü (çıplak) Ti tüp, 3 gün implantasyon sonra, tromboz ölçüde (deneyler aynı sonuçları ile süresi 3 hafta kadar yapılmıştır) . 3 gün implantasyon sonrası Ti tüp yüzey Şekil 8 EPC (QImaging QICAM dik bir Leica DMRB mikroskobu ile görüntülenmiş, dijital kamera ve Image Pro Plus yazılımı tek renkli) . (A) yüzeye Konfluent hücrelerin PKH26 ameliyat öncesi etiketleme gösteriyor. (B) EPC konfluent katmanı. Kırmızı: PKH26 ameliyat öncesi etiketleme. Yeşil: EPC PECAM-leke.