大動物モデルにおける心血管デバイス用自家血管内皮前駆細胞播種技術と生体適合性試験

1。内皮前駆細胞の分離前のEPC -シードチューブの注入から30日間は、抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液15mlで60mlの注射器を準備し、末梢豚の血液からEPC分離のための3ウェイストップコックで固定します。前の採血から24時間、プレコートタイプ1ラットのコラーゲンと2つの12ウェルプレート（50μg/ mlの、0.02 N酢酸溶液に溶解した）4。 実験動物の管理と利用のための健康ガイドラインの国立研究所に従い、かつ、唯一の監督機関動物実験委員会の承認後にすべての動物の世話と実験を実施する。 19 G蝶の針を介してアセプロマジン（1.1 mg / kg体重）とケタミン（22 mg / kg）を筋肉内で落ち着いた女性ヨークシャーブタ（45キロ）。 気管内チューブ（30 cmの長さ、内径8mm）で豚を挿管し、（マスクによる換気量の4.5％）イソフルランで豚を麻酔。 酸素飽和度、心拍数と温度を測定することにより、手順の間に豚を監視します。自動化された加熱された手術台と加熱毛布を使用し、注入液を温めることによって体温調節を維持する。 手術台の上に仰臥位で豚を置き、caudolaterallyその後肢を固定し、そしてDuraPrep滅菌が続くクロルヘキシジンできれい。その後、骨盤領域をドレープに進みます。 大腿静脈に触知大腿パルス（内側広筋の内側と薄筋の外側）にちょうど内側5 Fマイクロイントロデューサキット21からG × 7 cmの針を挿入し、Seldinger法を用いて静脈をカニューレを挿入する。血管内カテーテルに準備60mlのシリンジを接続し、血液の45 mlを描く。 止血（5分）を達成するために血管穿刺部位への圧力を保持し、麻酔を中止し、豚を回復する。動物は完全に回復するまで監視し、そのケージに戻されます。 血液ソリューションハンクスバッファ塩溶液と1:1（のCaCl 2、MgCl 2を 、MgSO 4を除く）と明確に定義されたレイヤーを作成するためにHistopaqueの同じボリューム上に層を希釈する。遠心分離（30分、740グラム、低ブレークの設定）と単核細胞（MNC）層を収集する。ダルベッコのリン酸で再懸濁し、洗浄多国籍企業× 3は完全増殖培地で2つの12ウェルプレート（EBM – 2 2％ブタ血清（PS）およびEGM – 2培地にプレーティングする前に（10分、515グラム）（DPBS）緩衝生理食塩水37 SingleQuots）° C、5％CO 2。 ゆっくりして最初の7日間、一日おきに24時間ごとに培地交換。平均時間後のEPCコロニーを識別するの7日間（ 図2）。 彼らは12ウェルの表面積の¼をカバーしたら文化のEPCを展開します。表面マーカーCD31とCD14の欠如の存在をテストしてフローサイトメトリーによるEPCのアイデンティティ、CD45を確認してください。実行することができる他のアッセイは、フロー4への曝露後の細胞の形態と窒素酸化物III活性が含まれています。 2。チタンチューブアセンブリ HHSは、スリット72の歯と3等しい120度の単位（4.5センチ）に長手方向にセクションチタンチューブは縦フライス盤で見たあずまやで固定されていた。 300rpmでそれを実行し、タップマジックカット中にすべての回で切削液（ 図3）で飽和した切削領域を保持します。 卓上グラインダーとスコッチブライトの金属加工ホイールで内面を磨く。その後、さらに滑らかで、表面に3Mエメリー布で手動で磨くには、表示可能なすべてのピットを削除する。 。水10数リットルで洗浄が続く王水（濃塩酸1:3濃硝酸）の水没5分、続いてAlconox石鹸溶液とチタンの部分を、きれいに王水は、腐食性の高い場合のように細心の注意を払ってくださいと潜在的に爆発！ 超音波処理Tiのセクションでは、Alconox石鹸の溶液中で× 16分、脱イオン水で× 30を上昇し、再び脱イオン水で× 16分を超音波処理してください。層流フード内で乾燥することができます。 4.5センチメートルの長さと2.4％徹底的にきれいにカットPVC熱収縮チューブ。 支持マンドレル（アルミ、8.5 mm外径から加工）とTiのセクションの周りPVC熱収縮チューブ（ 図4）の代わりにスリーブに3清浄Tiのセクションを配置するためにピンセットを使用してください。均等にしっかりと一緒にTiのセクションをラップするためにマンドレルを回しながらヒートガンで収縮チューブ。 3。シードデバイスとコンポーネントのアセンブリ 2.5センチメートルおよび3.5 cmの長さにシリコンチューブをカット。 第5節CC 0.8mlのマークでプラスチックシリンジとルアー終了と"ヘッドピース"してください。 2 ×シリコーンセクション、シリンジ"ヘッドピース"と2.4で説明されているように超音波処理によってルアーキャップを徹底的に清掃してください。 エクステン、2.5から組み立てられたチタン管の各端にシリコンチューブを追加PVCチューブも5 mmだけ鼎。 それはチタンチューブ（ 図5）を接するように、短いシリコンチューブにシリンジ"ヘッドピース"の端をカット挿入します。 シールは、タイベックのポーチとエチレンオキサイド（55℃18時間℃）でガス滅菌の1つのルアーキャップとチタンチューブアセンブリを終えた。 プレキシガラスのプラットフォームに同期タイミングモータ（10 RPH）をマウントし、シリンジホルダー（アルミから削り、5 ccシリンジに適合）（ 図6）に、その車軸を接続する。 4。チタンチューブ内面のEPC播種 1の下で単離されたEPCを展開しますコンフルエントT – 75フラスコ（または少なくとも9 × 10 6細胞）に。 手術当日に、長期的な色素と蛍光標識細胞（PKH26）11。無血清培地中で二回培養EPCを洗浄することから始めます。ラベリングの実行中と実行後の細胞を保護するために、光の露出を制限するため注意。 4分間室温で希釈Cの4μMPKH26（色素溶液）で細胞をカバーする。 ソリューションを染めるために、等量のブタ血清を添加することによりラベリング反応を停止します。一分後、完全増殖培地と組み合わせたソリューション1:1希釈。 液体を吸引し、完全増殖培地で細胞× 3をすすいでください。 （のCaCl 2、MgCl 2を除く）二回DPBSでEPCを洗う。 37℃でトリプシンとインキュベートのセルをカバーする3分​​間と、光学顕微鏡下で剥離を確認してください。使用されるトリプシンの二重量のトリプシン中和溶液を加える。 ピペッティングにより単管とのミックスに、セルのソリューションを組み合わせる。カウントのための血球計算板の両側に細胞溶液10μlを添加します。 遠心分離セルソリューション（1500 RPH、5分）。 2で細胞ペレットを再懸濁しますを数える- 2.5 × 10 6 [kW / mlの無血清培地中で。チューブアセンブリは4.5 mlの埋めるために最小音量に注意してください。 無菌フィールドのための生物学的なフード内で無菌タオルをレイアウト。オープン滅菌フィールド上にチタン管アセンブリと余分な5 ccシリンジガス滅菌。 滅菌手袋で、5 ccシリンジからプランジャーを取り外し、後で使用するためにフィールドにしてください。この注射器に貼ってルアーキャップ。 ピペットで4.5 -オープンシリンジバレルに4.9の下に5ミリリットルEPCサスペンション。安全に戻ってシリンジの開放端にプランジャーを挿入します。 上向きのキャップでシリンジを持ち、キャップを取り外します。チタンチューブ内に進んでいない。ぴったりまでチタン管アセンブリのオープンシリコンチューブへの最初のルアーの端にシリンジを挿入します。 アドバンスシリンジプランジャが徐々に細胞溶液は、システムから気泡を除去する"、ヘッドピース"カットシリンジの上部に達するまで。ルアーキャップを閉めて、テープで開放端を密封、滅菌シースにアセンブリ全体を挿入します。 3.7機械加工されたシリンジホルダーにこのアセンブリ全体を挿入します。 37℃インキュベーターで場所℃、播種チャンバのチタンチューブの部分は水のレベルゲージ（ 図6）を使用して 、レベルになるようにプラットフォームを調整する。 チタンチューブアセンブリは移植前に30​​分を回転することができます。 5。ブタ下大静脈へのチタンチューブの注入手術前に二十四時間、（経皮は100μg/時、場所で× 72時間のパッチを保つ）フェンタニルパッチで（EPCSが分離されたから）豚をpremedicate。 豚NPOを一晩保管し、抗生物質の予防として、術前に手術の日（5 mg / kgを、IM）で、次の7日間24時間ごとにBaytril（エンロフロキサシン）を管理する。 落ち着いた、挿管および1.3で説明したようにブタを麻酔（10 -15ミリリットル/ kgの一回換気量）と手術室のテーブルの上に仰臥位で豚を確保する。酸素飽和度、心拍数と温度を測定することにより、手順の間に豚を監視します。自動化された加熱された手術台と加熱毛布を使用し、注入液を温めることによって体温調節を維持する。 豚の耳静脈に18 G IVのカテーテルを挿入し、Vetropolycinの点眼で豚の目を保護する。 クリーン、準備および1.6のように、豚の腹部を羽織る。頭側尾側に設定された最後に第二に乳腺の2セット目から第15手術用メスの刃で正中を切開する。 電気焼灼と腹部筋膜に切開を下に運ぶ。 モスキート鉗子で腹膜を持ち上げ、慎重にMetzenbaumハサミでそれを入力してください。 膀胱を外部化し、膀胱の壁に3 – O Vicryl巾着縫合を置きます。その真ん中に刺し切開を置き、16 Fフォーリーカテーテルを挿入する。手術中に> / = 1ミリリットル/ kg / hrのために尿量を滴定する輸液（乳酸リンゲル）管理する。 続いて、小規模および大規模な腸と場所腹膜腔の後面を露出し、下大静脈（IVC）を識別するために2バルフォア外科開創器を外部化。 慎重に、シャープと鈍的切開を使用して周囲の組織からIVCを解放し、遠位IVCの分岐に近右腎動脈から血管を骸骨になる。 IVCでさえ非常に小さな欠陥が動物の急速な出血や失血につながる可能性があるため、IVCの解剖時の細心の注意を払ってください。 移植されるチタン管の周囲の出血がないことを保証するためにIVCのセグメントのすべての側枝を結紮。非常に慎重に解剖し、ライゲーションを必要とする通常大きな2腰椎静脈に注意してください。さらに、大腰静脈が下大静脈の分岐のすぐ近位の一般的な後内側で検出されると無料解剖とクランプの配置の準備として、血管ループで制御する必要がありますのでご注意ください。 同時に4で概説したようにチタンチューブをシードに進みます。 IVCをクランプする直前にヘパリンの100 USP / kgを投与する。遠位IVCと腰静脈に45度の角度外科クランプを配置し、近位に。 ポッツはさみで拡張子が続く＃11手術用メスの刃を使用して、近位および遠位クランプの間に縦veinotomy（4 cm）を作成します。 IVCから血液を退避させ、滅菌DPBSで、その内腔をフラッシュします。 今IVCにEPCシードのチタンチューブを（またはベアメタルコントロール）を挿入し、乾燥から細胞を防止し、空気を排気するようにDPBS（のCaCl 2、MgCl 2で）で塗りつぶす。 4から0 Prolene実行中の縫合糸でveinotomyを閉じて、バック出血の少量を通してデ – 空気IVC一つ近位クランプを取り外します。時間をかけてインプラントの移行を防止するためにPVCチューブに静脈壁を通してのご滞在、縫合糸"を置きます。 2 – O Vicryl（縫合を実行している）とCTの針と皮下のスペースにO – PDSと筋膜を閉じます。ステープルで皮膚を閉じます。 皮下切開部位に沿って0.25％Marcaine（ブピバカイン）の20mlにまで管理し、ガーゼとTegadermで傷口をカバーしています。皮下の痛みのために、必要に応じて – またフルニキシン（2.2 mg / kgのQ 24時間）とオキシモルホン（4時間0.15 mg / kgのQ 3）を得た。 麻酔を中止し、覚醒まで豚を監視し、ケージに戻ります。苦痛/痛み、地位、歩行、糞便および尿の出力、および正常な血流を示す皮膚の色の兆候を毎日二度豚を監視します。 6。チタン管の植 1.3で説明したように3週間後に、落ち着いた、豚を挿管し、麻酔- 1.4。 5.8 -として5.5で説明開腹に進んでください。 瘢痕化すると、インプラントのサイトを隠すでしょうが、 その場で剛性チタンチューブを触診できることに注意してください。 として5.9に説明したIVCばらばらにする- 5.11と重いハサミで周囲のIVCとチタンチューブエンブロックを外植片。 Euthasol安楽死溶液（390 mg / mlのペントバルビタールナトリウムとを1ml / 10ポンドで50 mg / mlのフェニトインナトリウム）で動物を安楽死させる。 7。固定とイメージングのTi内面 DPBS溶液中のチタン管を摘出した静脈のセグメントをすすぎ、高解像度デジタルカメラ（ 図7）でその内腔（特許または閉塞）を撮影する。 続いて、15​​分の最小値は3.7％パラホルムアルデヒドで水没によって試料を修正。 DPBS溶液中で試料を洗浄します。 非常に慎重に周囲の静脈やチタンチューブを開くためにPVCチューブを切開する。赤/オレンジ色（ 図8A）にPKH26標識EPCを可視化するために550nmの励起波長の下で客観的/光源と画像が直面している内側の表面と蛍光顕微鏡下で3つのセクションに置きます。必要に応じて、細胞（例えば、血小板内皮細胞接着のマーカー（PECAMセルの罫線（ 図8B）、核を可視化するためにDAPI -染色、などを可視化する） -染色）さらに染色可能です。 8。代表的な結果： このプロトコルの実行の後、医師や科学者が大規模な動物モデルにおける自己血由来の内皮前駆細胞と固体チューブ構造をendothelializeすることができる。 図は、私たちの方法で分離されたEPCはは約7日後には石畳の形態を持つコロニーとして表示される2に示すように文化。 図5と図6に示す私たちのシードデバイスは、無菌条件下9条管の内面の均一なカバレッジのEPCサスペンションと結果で満たされたチタンチューブの遅い回転することができます。 私たちの移植手術は大動物モデルにおける血栓症のために、例えばTiのような生体材料の傾向を、テストすることができます。我々は、豚はよく、この手順を容認することと、この移植が唯一の最小限の失血とし、EPCの層を中断させることなく達成できることを見出した。 私たちのEPCライニング管であっても下大静脈の血栓症、低せん断環境で特許残るのに対し、裸の ​​チタン管が完全に、閉塞いるT"> 図7に示す。さらに、蛍光標識細胞のコンフルエントな層の存在が確認さ図8に示すように、この方法の成功。 図1。自家血管内皮前駆細胞（EPC）播種実験の模式図。最初に、末梢血はブタから描かれています。次に、EPCは血液から分離し、培養で増殖されています。 EPCはその後、その後、外科的に細胞が単離されたから、同じ豚の下大静脈に注入されるチタン（Ti）チューブのデバイスを、整列するために使用されます。 図2。文化のEPCは、単離操作後約7日間（イメージングカメラとQCaptureソフトウェアと反転ライカDMIL顕微鏡で撮像）の代表コロニー。 組立て前に図3。チタンチューブセクション。チタンチューブは、長手方向に3等分に切断し、4.5センチメートルの長さに切断される。 Tiのセクションの内側の表面は目に見えるピットを削除するには、卓上グラインダーとエメリー布を使用して研磨されています。 図4。PVC熱収縮チューブ（青）とヒートガンを持つチタン管セクションの組み立て。 Tiのセクションは、Tiのセクションを通って延びるとTiのチューブ内径の寸法に一致するアルミ削り出しのマンドレル上でサポートされています。 図5チタン管アセンブリ、すべてのコンポーネントを表示：PVCラップ（青）とルアーキャップ、注射器"ヘッドピース、"シリコンチューブ、およびチタンチューブ。アセンブリは、外科的使用のために滅菌前に一緒に置かれている。 モーター、プラットフォームを示すインキュベーター内部に図6。チタンチューブシードセットアップは、アルミのシリンジホルダー、チタン管アセンブリ、および5 ccシリンジを機械加工。注：アセンブリは、可視化の目的のために保護滅菌シースなしで表示されます。 図7。移植手術の代表的な粗結果。ブタ下大静脈（IVC）において、移植後の制御ベアメタルのTi管の（A）エンドビュー。内腔が完全に固体の塊で閉塞しているチューブ。注入後のEPCシードのチタンチューブの（B）エンドビュー。チューブ内腔は完全に特許とは明らかである。対照の（C）ディテールに秘められたビュー（裸）チタンチューブ3日間注入した後、血栓症の程度を（実験は同一の結果と3週間の期間までに実施された）を示す。 図8。3日間の移植後のチタンチューブの表面上のEPC（デジタルカメラやイメージプロプラスソフトウェアをモノクロQImaging QICAMで直立ライカDMRB顕微鏡で撮像）。 （A）PKH26手術前のラベルを示す表面上にコンフルエントな細胞。 EPCの（B）コンフルエントな層。赤：PKH26手術前のラベリング。グリーン：EPC PECAM -染色。