עצמיים אבי האנדותל Cell-מתזמן טכנולוגיה בדיקה biocompatibility עבור התקנים לב וכלי דם במודל חיה גדולה
Summary
שיטה טיטניום זריעת דם biomaterials ליצור קשר עם תאים עצמיים ו biocompatibility בדיקות מתואר. שיטה זו משתמשת ובתאים אנדותל צינורות טיטניום, זורעים בתוך דקות של ניתוח ההשתלה לתוך חזירי venae cavae. טכניקה זו ניתנת להתאמה מכשירים רבים אחרים ביו מושתלת.
Abstract
מכשירים מושתלת הלב וכלי הדם מיוצרים מחומרים מלאכותיים (כגון טיטניום (TI), הרחיבה polytetrafluoroethylene), אשר מהווים את הסיכון של היווצרות thromboemboli 1,2,3. פיתחנו שיטה לקו המשטח הפנימי של שפופרות טי עם עצמיים דם שמקורם בתאים אנושיים או חזירי אבי האנדותל (EPCs) 4. ידי השתלת צינורות טי המכיל שכבת ומחוברות של EPCs חזירי ב נחות הווריד הנבוב (IVC) של חזירים, בדקנו את biocompatibility משופרת של שטח פני התא, וזרע בסביבה prothrombotic במודל חיה גדולה והשווה אותה ללא שינוי משטחי מתכת חשוף 5,6,7 (איור 1). שיטה זו יכולה לשמש endothelialize התקנים תוך דקות ההשתלה מבחן תפקוד antithrombotic שלהם in vivo.
דם היקפיים התקבל 50 ק"ג יורקשייר החזירים שבר תא mononuclear שלה תרבותי לבודד EPCs 4,8. טי צינורות (9.4 מזהה מ"מ) היו מראש לחתוך לשלושה חלקים 4.5 ס"מ אורך ו מחדש עם צינורות חום להתכווץ. מכשיר זריעת נבנה, אשר מאפשר סיבוב איטי של צינורות טי.
ביצענו laparotomy על חזירים ועל מוחצן במעי ואת שלפוחית השתן. דיסקציה שארפ ובוטה שימש skeletonize IVC מתוך הסתעפות דיסטלי אל עורק הכליה הימנית הפרוקסימלי שלו. צינורות טי היו מלאים אז עם fluorescently שכותרתו עצמיים ההשעיה וסובב EPC ב 10 דקות RPH 30 x להשיג מדים תא ציפוי 9. לאחר מתן הפרין USP / ק"ג 100, בשני הקצוות של IVC ווריד המותני היו לכודים. Veinotomy 4 ס"מ בוצע המכשיר מוכנס ומלא פוספט שנאגרו מלוחים. ככל veinotomy נסגר עם תפר Prolene 4-0 ריצה, אחד מהדק הוסר דה האוויר IVC. בסוף ההליך, fascia היה מקורב עם 0-PDS (polydioxanone תפר), שטח סגור תת עורית עם Vicryl 2-0 והעור מהודקים סגור.
אחרי 3 – 21 יום, חזירים היו מורדמים, המכשיר explanted en-בלוק קבוע. צינורות טי היו מפורקים המשטחים הפנימיים צילמו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
מצאנו כי צינורות מתכת חשוף טי occluded מלא ואילו EPC-seeded צינורות נשאר פטנט. יתר על כן, הצלחנו להדגים שכבה ומחוברות של EPCs על פני דם פנייה פנימה.
לסיכום, הטכנולוגיה שלנו יכולה לשמש endothelialize צינורות טי בתוך דקות של ההשתלה עם EPCs עצמיים כדי למנוע פקקת של המכשיר. השיטה שלנו מאפשרת ניתוח לבדיקת biocompatibility משופרת של מכשירים שונה כגון עם איבוד דם מינימלי EPC-seeded שיבוש פני השטח.
Protocol
Discussion
השיטה של התא זריעת צינורות טי המוצג כאן מאפשר רופאים ומדענים במהירות אחידה endothelialize דם פנייה פני השטח של מכשירים להשתלה. מכיוון שאנו לבודד להרחיב EPCs מתוך דגימות דם היקפיים, הליך לא פולשני הגדולות נדרש קציר תאים אלה. יתר על כן, EPCs הם עצמיים, ולכן את הסיכון של כל תגובה חיסונית להשתיל תאים seeded מסולקת. עקרונות הפגינו פרוטוקול שלו יכול להיות מנוצל לא רק צינורות טי, אבל biomaterials רבים אחרים, אשר מנוצלים ברפואה לב וכלי דם.
צעדים קריטיים בפרוטוקול זה ניקוי קפדני של צינורות טי, כפי שמצאנו שכל הסרט חסיד של דבקות פשרות המזהם התא. יתר על כן, מהירות סיבוב איטי (ביחס הפוך בקוטר הצינור) חיוני בתהליך זריעה, כגון EPCs שיכולים להתיישב לאט לדבוק פני השטח כמו צינור טי נע.
השיטה שלנו של זריעת מיד לפני ההשתלה נמנעת מעשי vivo לשעבר פעמים ותרבות; תאים לדבוק בנפרד ולאחר מכן טופס גיליון ומחוברות in vivo, למנוע את האפשרות של אמבוליזציה כסיד מיד לאחר הקמתה מחדש של תזרים. מחקרים קודמים שלנו מראים כי פעם EPCs גדלו לשכבה ומחוברות, הם עושים מטריצה חוץ תאית שבה הם דבקים בחוזקה, בנוסף מזעור כל נשל אפשרי של גיליון האנדותל. למרות האפשרות של ניתוק תסחיפי לא ניתן לשלול לחלוטין החוצה, נראה שזה סיכון נמוך יותר מאשר multifold פקקת של פני השטח את המכשיר כולו, הבעיה שזה טיפול נועד למנוע.
הגישה שלנו של ההשתלה לתוך גזירה נמוכה, סביבה prothrombotic של נחות הווריד הנבוב מנצל אחד הדגמים האמינים ביותר חיה גדולה למחקר תאימות דם ופקקת של מכשירים 5,6. שים לב כי כל טיפול בבעלי חיים לניסויים נערך בהתאם המכון הלאומי לבריאות הנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ורק לאחר אישור של הדוכס טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת מוסדיים ועדת שימוש.
על מנת לנצל בהצלחה בשיטה זו כדי לבדוק את ההשתלה biomaterials והתקנים, חשוב בסבלנות skeletonize קטע IVC ו ולקשור את כל ענף כלי ורידי לקראת הכניסה המכשיר, כך שאין דימום סביב המכשיר מקורו "לומן שווא". שלב קריטי נוסף הוא תוספת של DPBS לתוך לומן מכשיר כזה התאים על פני השטח בתוך צינור להישאר לחה במהלך סגירת veinotomy ולפני reperfusion היא יזמה. אם המכשיר לא ניתן למצוא את המיקום שבו הוא מושתל, זה יכול להיות היגרו "במעלה הזרם" ב-IVC. זה ניתן למנוע על ידי הנחת תפר (4-O Prolene) דרך הקיר דרך וריד 2 – סעיף 3 מ"מ בצינור PVC כך צינור מעוגן היטב למקומו הנוכחי. החוקר צריך מתקשים למצוא תאים טרום fluorescently שכותרתו שמוצג באיור 8 לאחר explantation בצינור פטנט אחרת, סביר להניח כי התאים יש קילף כגיליון קוהרנטית. זה ניתן למנוע על ידי לנתיחה מאוד עדין של הווריד שמסביב דיס הרכבה של 3 חלקים טי צינור, לאחר תיקון ברוח יחד עם הצינורית.
הטכנולוגיה שלנו מספקת הוכחה של קונספט למניעת פקקת מכשיר לב וכלי דם באמצעות זריעת-EPC. טכנולוגיה זו עשויה לשמש בפיתוח שתלים "הביוגניים" מדופן התאים עצמו המטופלים אבי האנדותל. בדיקת היתכנות במודל חיה חזירי שלנו מספק את הצעדים הראשונים לקראת התרגום של "רפואה אישית" זה לתוך הפרקטיקה הקלינית.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות Leica Microsystems עצה יקר שלהם על חלקים הדמיה טיטניום ג'מיני Bio-מוצרים עבור מתן נסיוב חזירי השתמשו במחקר זה. כמו כן, אנו רוצים להודות-NIH על תמיכתם באמצעות גרנט "רירית EPC עצמיים כדי לשפר את biocompatibility של הדם ולסייע התקנים", RC1HL099863-01. יתר על כן, אנו אסירי תודה על התמיכה של הקרן הלאומית למדע בוגר מחקר של אחוות אלכסנדרה Jantzen. כמו כן, אנו רוצים להודות ג'ורג' מהירה, מייק לאו Ianthia פארקר לסיוע עם היבטים רבים של ההליך הכירורגי וטיפול בבעלי חיים במחקר שלנו. סטיבן אואן כבר לא יסולא בפז עיבוד חלקים רבים של המכשיר זריעת שלנו חיתוך צינורות טיטניום.
Materials
| Reagent | Company Name | Catalogue Number | Comments |
| Acepromazine | Boehringer-Ingelheim | BIC670025 | NAC# 10280002 |
| Alconox Powered Precision Cleaner | Alconox | 1104 | |
| Balfour Surgical Retractor | Adler | N/A | |
| Baytril | Bayer | APVMA 46028/0705 | |
| Butterfly Needle (19G) | Terumo | SV19CLK | |
| Chlorhexidine | 3M | 9200 | |
| Clamps (45-degree) | Aesculap | FC339T | |
| DPBS (-/-) | Gibco | 14190-144 | |
| DPBS (+/+) | Gibco | 14040-133 | |
| DuraPrep | 3M | 8635 | |
| EBM-2 Medium | Lonza | CC-3156 | Base for both serum free and full growth medium |
| EGM-2 SingleQuots | Lonza | CC-3162 | Used with EBM-2 for both serum free and full growth medium |
| Electrocautery Tool | Valleylab | SurgII-20 | |
| Emery Cloth | 3M | 60-0700-0425-8 | 240 grit |
| Euthasol Euthanasia Solution | Virback Animal Health | ANADA #: 200-071 | |
| Fentanyl Patch | Actavis | NDC # 67767-120-18 | |
| Flunixin | Schering-Plough | NAC #: 10470183 | |
| Foley Catheter (16F) | Bard | 730116 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heat Gun | Milwaukee | 8988-20 | |
| Heparin | NDC #: 25021 | ||
| Histopaque-1077 | Sigma | H8889-500ML | |
| Intubation Tube | Mallinckrodt | 86113 | |
| Isoflurane | MWI, Meridian | NDC #13985-030 | |
| IV Catheter (18G) | Becton-Dickinson | 381547 | |
| Ketamine | Fort Dodge | NDC #0856-2013 | |
| Level | Swanson | LLA001 | |
| Luer-Lock tip cap | CML Supply | 909-001 | |
| Marcaine | Hospira | NDC #: 0409-1560-10 | |
| Metzenbaum Scissors | Adler | N/A | |
| Micro-introducer (5F) | Galt | KIT 002-01 | |
| Mosquito Forceps | Adler | N/A | |
| Motor | Herbach and Rademan | H1-08 | |
| Oxymorphone | Endo Labs | NDC: 63481-624-10 | |
| PKH26 Dye Kit | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| Porcine Serum | Gemini Bio-Products | 100-115 | 2% concentration in full growth medium |
| Potts Scissors | Adler | N/A | |
| Precise Vista Skin Stapler | 3M | 3998 | |
| PVC Tubing | McMaster-Carr/Insultab | 7132K117 | expanded ID 15.88 mm, recovered ID 7.95 mm |
| Right Angle Medium Size | Adler | N/A | |
| Scalpel Blade (#10-15) | Bard | 373910 | |
| Silicone Tubing | McMaster-Carr | 51735K26 | 16.64 mm OD, 9.52 mm ID |
| Syringe (5 cc) | Becton-Dickinson (BD) | 309603 | |
| Tegaderm | 3M | 90001 | |
| Three-way Stopcock | Kendall | 170060 | |
| Ti Tube | Tico Titanium | N/A | Specified as ½” OD, .065″ wall, .370″ ID, .1737 lbs/ft |
| Trypsin | Lonza | CC-5012 | |
| Trypsin Neutralizing Solution (TNS) | Lonza | CC-5002 | 0.03% |
| Vetropolycin | Pharmaderm Animal Health | NAC #: 12920110 | |
| Vicryl Suture (3-0) | Ethicon | J808T | |
| Water Bath Sonicator | Branson | B200 |
References
- Achneck, H. E. Pathophysiology of bleeding and clotting in the cardiac surgery patient: from vascular endothelium to circulatory assist device surface. Circulation. 122, 2068-2077 (2010).
- Achneck, H. E., Sileshi, B., Lawson, J. H. Review of the biology of bleeding and clotting in the surgical patient. Vascular. 16, 6-13 (2008).
- Arvidsson, S., Askendal, A., Tengvall, P. Blood plasma contact activation on silicon, titanium and aluminium. Biomaterials. 28, 1346-1354 (2007).
- Achneck, H. E. The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants. Biomaterials. 32, 10-18 (2011).
- Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease. Thromb Haemost. 89, 256-263 (2003).
- Ueberrueck, T. Comparison of the ovine and porcine animal models for biocompatibility testing of vascular prostheses. J Surg Res. 124, 305-311 (2005).
- Velik-Salchner, C. Normal values for thrombelastography (ROTEM) and selected coagulation parameters in porcine blood. Thromb Res. 117, 597-602 (2006).
- Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Achneck, H. E. . American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. , (2010).
- Achneck, H. E. Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy. Microsc Res Tech. 73, 71-76 (2010).
- Ford, J. W., Welling, T. H., Stanley, J. C., Messina, L. M. PKH26 and 125I-PKH95: characterization and efficacy as labels for in vitro and in vivo endothelial cell localization and tracking. J Surg Res. 62, 23-28 (1996).
