Autologe endotheliale Vorläuferzellen Cell-Sätechnik und Biokompatibilitätstestung Für Herz-Kreislauf-Geräte in Großtiermodell

1. Endotheliale Vorläuferzellen Zellisolation Dreißig Tage vor der EPC-seeded Rohr Implantation vorzubereiten einer 60 ml Spritze mit 15 ml Antikoagulans Citrat Dextrose-Lösung und sichern mit einem 3-Wege-Hahn für EPC Isolierung aus dem peripheren Blut Schwein. 24 Stunden vor der Blutabnahme, Anschwemmfilter zwei 12-Well-Platten mit Typ-1-Ratte Kollagen (50 ug / ml, gelöst in 0,02 N Essigsäure-Lösung) 4. Führe alle Tierpflege und Experimente in Übereinstimmung mit dem National Institute of Health Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren und nur nach Genehmigung der Aufsicht Institutional Animal Care und Verwenden Committee. Sedate eine weibliche Yorkshire Schwein (45 kg) mit Acepromazine (1,1 mg / kg) und Ketamin (22 mg / kg) intramuskulär über eine 19 G Butterfly-Nadel. Intubieren das Schwein mit einem Endotrachealtubus (30 cm Länge, 8 mm ID) und betäuben Schwein mit Isofluran (4,5% des Tidalvolumen von Maske). Überwachen Sie die Schweine während des Verfahrens durch Messung der Sauerstoffsättigung, Herzfrequenz und Temperatur. Pflegen Sie Thermoregulation durch eine automatisierte beheizten OP-Tisch und Heizdecke und durch Erwärmung der infundierten Flüssigkeiten. Legen Sie das Schwein in Rückenlage auf dem OP-Tisch, sicheren seine Hinterbeine caudolaterally und sauber mit Chlorhexidin durch DuraPrep Sterilisation gefolgt. Dann mit Drapierungen Bereich des Beckens vor. Legen Sie eine 21 G x 7 cm lange Nadel von einem 5-F Mikro-Einführungsbesteck nur medial zu einer spürbar Femoralispuls (medial des M. vastus medialis und lateral des M. gracilis) in die V. femoralis und kanülieren die Vene mit Seldinger-Technik. Schließen Sie das vorbereitete 60 ml Spritze mit dem intravaskulären Katheter und zeichnen 45 ml Blut. Halten Sie den Druck auf das Schiff Punktionsstelle zur Blutstillung (5 min) zu erreichen, brechen Sie die Anästhesie und wieder das Schwein. Das Tier ist bis zur vollständigen Genesung überwacht und kehrte zu seinem Käfig. Verdünnen das Blut-Lösung 1:1 mit gepufferten Salz Hank-Lösung (ohne CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4) und Schicht auf gleiche Volumina Histopaque klar definierte Schichten zu erstellen. Zentrifuge (30 min, 740 g, niedrige Break-Einstellung) und sammeln mononukleären Zellen (MNC)-Schicht. Resuspendieren und waschen MNCs x 3 mit Dulbeccos Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10 min, 515 g) vor dem Ausplattieren in zwei 12-Well-Platten in voller Wachstumsmedium (EBM-2 Medium mit 2% Porcine Serum (PS) und EGM-2 SingleQuots) bei 37 ° C, 5% CO 2. Langsam Medium alle 24 Stunden für die ersten 7 Tage, dann jeden zweiten Tag zu ändern. Identifizieren EPC Kolonien nach einer durchschnittlichen Zeit 7 Tage (Abbildung 2). Expand EPCs in Kultur, wenn sie ein Viertel der 12-Well-Fläche zu decken. Bestätigen EPC Identität mit der Durchflusszytometrie durch die Prüfung auf das Vorhandensein von Oberflächenmarker CD31 und das Fehlen von CD14, CD45. Andere Tests, die durchgeführt werden können, schließen Zellmorphologie und Stickoxid III-Aktivität nach Exposition mit 4 fließen. 2. Titanium Tubus Abschnitt a Ti Rohr der Länge nach in 3 gleich 120-Grad-Einheiten (4,5 cm lang) mit einem 72 Zähne HHS Schlitzen sah in Platz durch eine Sägewelle in eine vertikale Fräsmaschine statt. Starten Sie es bei 300 RPM und halten Sie die Schnittfläche mit Tap Magie Schneidflüssigkeit jederzeit während des Schnitts (Abbildung 3) gesättigt. Polnische der inneren Oberfläche mit einem Schleifbock und Scotch-Brite Metallbearbeitung Rad. Dann manuell Politur mit 3M Schmirgelleinen weiter glatte und gleichmäßige Oberfläche zu entfernen alle sichtbaren Gruben. Reinigen Sie die Ti Stücke mit Alconox Seifenlösung, von 5 min Eintauchen in Königswasser (1:3 konzentrierter Salpetersäure, konzentrierte Salzsäure), durch Spülen mit mehreren Litern Wasser 10 gefolgt. Äußerste Vorsicht folgte als Königswasser ist stark ätzend und explosionsgefährdeten! Ultraschallbad Ti Abschnitte x 16 min in Alconox Seifenlösung, steigen x 30 in VE-Wasser und beschallen wieder x 16 min in deionisiertem Wasser. Lassen Sie die in Laminarströmungshaube trocken. Cut PVC Schrumpfschlauch bis 4,5 cm Länge und gründlich zu reinigen pro 2,4. Sie mit einer Pinzette auf die 3 gereinigt Ti Schnitte auf eine unterstützende Dorn (gefertigt aus Aluminium, 8,5 mm OD) und Platz Ärmel PVC Schrumpfschlauch um Ti Abschnitten (Abbildung 4) statt. Schrumpfschlauch mit einer Heißluftpistole beim Drehen Dorn gleichmäßig wrap Ti Abschnitte eng zusammen. 3. Seeding Gerät und Baugruppenmontage Cut Silikonschlauch mit einer Länge von 2,5 cm und 3,5 cm. § 5 cc Kunststoff-Spritze an die 0,8-ml-Markierung und halten "Kopfstück" mit Luer-Ende. Gründlich reinigen 2 x Silikon Abschnitte, Spritze 'Kopfstück' und ein Luer-Kappe durch Beschallung wie unter 2.4 beschrieben. Add Silikonschlauch an jedem Ende der versammelten Ti Rohr von 2,5, extending von 5 mm über PVC-Schlauch. Legen Sie abgeschnittene Ende der Spritze "Kopfstück" in kurzen Silikonschlauch, so dass es Ti Rohr (Abbildung 5) anliegt. Seal fertig Ti Tubus mit einem Luer-Kappe in Tyvek Beutel und mit Ethylenoxid (18 Stunden bei 55 ° C) gas-sterilisiert. Montieren Sie einen synchronen Timing-Motor (10 RPH) auf eine Plexiglas-Plattform und verbinden ihre Achse, um eine Spritze Halter (bearbeitet aus Aluminium, passend für 5 cc Spritze) (Abbildung 6). 4. EPC-Aussaat von Ti Rohr inneren Oberfläche Expand EPCs wie unter 1 isoliert. Bis 3 konfluenten T-75 Flaschen (oder mindestens 9 x 10 6 Zellen). Am Tag der Operation, fluoreszierend Label-Zellen mit langfristigen Farbstoff (PKH26) 11. Beginnen Sie mit dem Spülen kultivierten EPCs zweimal in serumfreiem Medium. Vorsicht ans Licht Grenzwert von Zellen während und nach der Etikettierung zu schützen. Cover-Zellen mit 4 uM PKH26 in Diluent C (Farbstofflösung) bei Raumtemperatur für 4 Minuten. Stop-Kennzeichnung Reaktion durch Zugabe von Schweinen Serum in gleichen Volumen an Lösung zu färben. Einer min später, verdünnte kombinierte Lösung 1:1 mit voller Wachstumsmedium. Flüssigkeitsaufnahme und spülen Zellen x 3 mit voller Wachstumsmedium. Wash EPCs zweimal in DPBS (ohne CaCl 2, MgCl 2). Cover-Zellen in Trypsin und bei 37 ° C für 3 Minuten ein und bestätigen Distanz unter einem Lichtmikroskop. Add Trypsin Neutralisationslösung in das doppelte Volumen von Trypsin verwendet. Kombinieren Sie Zell-Lösungen in einer einzigen Röhre und durch Pipettieren gründlich mischen. Add 10 ul Zell-Lösung in jede Seite einer Zählkammer zum Zählen. Zentrifugenzelle Lösung (1500 RPH, 5 min.). Zählen von Zellen und Pellet bei 2 bis 2,5 x 10 6 EPCs / ml in serumfreiem Medium. Beachten Sie die minimale Lautstärke zu füllen Tubus beträgt 4,5 ml. Legen Sie sterilen Tuch in biologischen Haube für sterilen Bereich. Öffnen gassterilisiert Ti Rohr Montage und zusätzlich 5 ml-Spritze auf sterilen Bereich. Mit sterilen Handschuhen, entfernen Kolben aus 5 ml-Spritze und halten auf dem Feld für die spätere Verwendung. Bringen Luer-Kappe auf diese Spritze. Pipettieren der 4,5 bis 5 ml EPC Suspension unter 4,9 in die offene Spritze. Legen Kolben sicher zurück in das offene Ende der Spritze. Die Spritze mit Kappe nach oben und Kappe entfernen. Legen Spritze mit Luer-Ende zuerst in offenen Silikonschlauch von Ti Tubus handfest; nicht in Ti Rohr voraus. Advance-Spritzenkolben langsam bis Zell-Lösung erreicht oben geschnitten Spritze "Kopfstück", Entfernung von Blasen aus dem System. Schließen Sie mit Luer-Kappe und stecken gesamte Baugruppe in sterile Mantel, Schließen von offenen Ende mit Klebeband. Fügen Sie diesen gesamten Baugruppe in bearbeiteten Spritzenhalter von 3,7. Legen Sie in Brutschrank bei 37 ° C und passen Plattform, so dass Ti Rohrabschnitt der Aussaat Kammer Ebene, mit Wasserstandsanzeiger (Abbildung 6). Lassen Ti Tubus bis 30 Minuten vor der Implantation zu drehen. 5. Die Implantation von Ti Rohr in Schweinen untere Hohlvene Vierundzwanzig Stunden vor der Operation, premedicate das Schwein (aus dem EPC isoliert wurden) mit einem Fentanyl-Pflaster (100 ug / h transdermales; halten Patch an Stelle x 72 Stunden). Halten Sie Schwein NPO Nacht und verwalten Baytril (Enrofloxacin) präoperativ am Tag der Operation (5 mg / kg, IM) und für 7 Tage nach, alle 24 Stunden als Antibiotikaprophylaxe. Sedate, intubieren und betäuben das Schwein, wie unter 1.3 beschrieben (Tidalvolumen von 10 -15 ml / kg) und sichern Sie das Schwein in Rückenlage auf dem Operationstisch. Überwachen Sie die Schweine während des Verfahrens durch Messung der Sauerstoffsättigung, Herzfrequenz und Temperatur. Pflegen Sie Thermoregulation durch eine automatisierte beheizten OP-Tisch und Heizdecke und durch Erwärmung der infundierten Flüssigkeiten. Legen Sie eine 18 G IV-Katheter in die Schweine-Ohrvene und schützen Schwein in die Augen mit Vetropolycin Augentropfen. Clean, desinfizieren und steril abdecken das Schwein den Bauch, wie in 1.6. Inzision der Mittellinie mit einem # 15 Skalpell aus dem 2. Satz von Brustdrüsen kranial der 2. bis kaudal im vergangenen. Tragen Sie die Dissektion bis zum Bauchfaszie mit Elektrokauter. Heben Sie das Bauchfell mit Mosquito Zange, und vorsichtig geben Sie es mit Metzenbaum Schere. Externalize der Harnblase und legen Sie eine 3-O Vicryl Tabaksbeutelnaht in die Blasenwand. Legen Sie eine Stichinzision in der Mitte und legen Sie eine 16 F Foley-Katheter. Verwalten intravenösen Flüssigkeiten (Laktat-Ringer), um die Urinausscheidung zu titrieren> / = 1 ml / kg / h während der Operation. Nach, externalisieren der Dünn-und Dickdarm und Platz zwei Balfour chirurgischen Retraktoren auf den hinteren Teil der Bauchhöhle zu entlarven und zu identifizieren die untere Hohlvene (IVC). Mit scharfer und stumpfer Präparation, vorsichtig kostenlos die IVC vom umgebenden Gewebe und Skelettierung des Schiffes von der rechten Nierenarterie proximal der Bifurkation der IVC distal. Übung extreme Sorgfalt bei der IVC Dissektion als auch eine sehr kleine Fehler in der IVC schnelle Blutung und Ausbluten des Tieres führen kann. Ligieren alle Seitenäste der IVC-Segment, um sicherzustellen, dass es keine Blutungen um die Ti Rohr implantiert werden. Beachten Sie die in der Regel große beiden hinteren Lendenwirbel Venen, die sehr vorsichtige Präparation und Ligation erfordern. Darüber hinaus beachten Sie, dass unmittelbar proximal der Bifurkation der IVC, eine große Vene Lendenwirbelsäule wird häufig auf die posteromedial Seite gestoßen und muss frei präpariert und kontrolliert mit Vesselloops in Vorbereitung Klammer Platzierung werden. Fahren Sie mit der Aussaat der Ti Rohr gleichzeitig als unter 4 dargestellt. Verwalten 100 USP / kg Heparin unmittelbar vor dem Einspannen des IVC. Legen Winkel von 45 Grad chirurgische Klammern distal an der IVC-und Lendenwirbelsäule Vene, und dann proximal. Erstellen Sie eine longitudinale veinotomy (4 cm) zwischen den proximalen und distalen Klemmen mit einem # 11 Skalpell durch Erweiterung mit Potts Schere gefolgt. Evacuate kein Blut aus der IVC und bündig seine innere Lumen mit steriler DPBS. Legen Sie nun die EPC-seeded Ti Rohr (oder eine Bare-Metal-Kontrolle) in die IVC und füllen es mit DPBS (mit CaCl 2, MgCl 2), um die Zellen vor dem Austrocknen zu verhindern und die Luft zu evakuieren. Schließen Sie die veinotomy mit 4-0 Prolene fortlaufenden Naht und entfernen Sie eine proximale Klemme zu de-air der IVC durch eine kleine Menge von Back-Blutungen. Legen Sie ein "stay-Naht" durch die Venenwand in den PVC-Schlauch zur Migration des Implantats im Laufe der Zeit zu verhindern. Schließen Sie die Blende mit O-PDS auf einem CT Nadel und des subkutanen Raum mit 2-O Vicryl (fortlaufenden Naht). Schließen Sie die Haut mit Klammern. Verwalten von bis zu 20 ml 0,25% Marcain (Bupivacain) subkutan entlang der Inzisionsstelle und decken Sie die Wunde mit Gaze und Tegaderm. Auch geben Flunixin (2,2 mg / kg Q 24 Std.) und Oxymorphon (0,15 mg / kg Q 3 bis 4 Stunden) subkutan als für Schmerzen benötigt. Unterbrechen Sie Anästhesie-Monitor das Schwein bis wach und zum Käfig. Monitor-Schwein zweimal täglich auf Anzeichen von Kummer / Schmerz, Stehen und Fortbewegung, Stuhl und Urin-Ausgang, und Hautfarbe zeigt den normalen Perfusion. 6. Explantation von Ti Rohr Nach 3 Wochen, gesetzt, intubieren und betäuben das Schwein als in 1.3 beschrieben – 1,4. Gehen Sie mit einem Bauchschnitt, wie in 5.5 beschrieben – 5,8. Beachten Sie, dass Narbenbildung wird die Implantationsstelle zu verbergen, aber Sie können die starren Ti Rohr in situ zu betasten. Sezieren die IVC wie in 5.9 beschrieben – 5.11 und Explantation des Ti Rohr en-Block mit den umliegenden IVC mit schweren Schere. Euthanize das Tier mit Euthasol Euthanasie-Lösung (390 mg / ml Pentobarbital-Natrium und 50 mg / ml Phenytoin Natrium bei 1 ml / 10 lbs). 7. Fixation und Imaging-Ti inneren Oberfläche Spülen Sie den ausgeschnittenen Venensegment mit Ti Rohr in DPBS Lösung und fotografieren ihre Lumen (Patent-oder verschlossen) mit einer hochauflösenden Digitalkamera (Abbildung 7). Nach, fixieren Sie die Probe durch Eintauchen in 3,7% Paraformaldehyd für mindestens 15 Minuten. Rinse Probe in DPBS Lösung. Sehr sorgfältig incise die umliegenden Venen-und PVC-Schläuche, die Ti Rohr zu öffnen. Legen Sie die 3 Sektionen unter einem Fluoreszenzmikroskop mit den inneren Oberflächen vor dem Ziel / Lichtquelle und Bild unter 550 nm Anregungswellenlänge zu PKH26-markierten EPCs in rot / orange Farbe (Abbildung 8A) zu visualisieren. Wenn gewünscht, können die Zellen weiter gefärbt (zB Platelet Endothelial Cell Adhesion Marker (PECAM)-Fleck Zellrahmen (Abbildung 8B), DAPI-Färbung auf Kerne sichtbar zu machen, etc. zu visualisieren). 8. Repräsentative Ergebnisse: Nach der Ausführung dieses Protokolls sind Ärzte und Wissenschaftler in der Lage, feste Rohr Strukturen mit Eigenblut-derived endothelialen Vorläuferzellen in einem großen Tiermodell endothelialize. Abbildung 2 zeigt, dass EPCs mit unserer Methode isoliert als Kolonien mit Kopfsteinpflaster Morphologie erscheint nach ca. 7 Tage in Kultur. Unsere Aussaat-Gerät in den Abbildungen 5 und 6 dargestellt ermöglicht langsame Rotation des Ti Rohre mit dem EPC Federung und die Ergebnisse in eine gleichmäßige Abdeckung des Rohres der inneren Oberfläche unter sterilen Bedingungen 9 gefüllt. Unsere Implantationschirurgie ermöglicht die Prüfung der Neigung von Biomaterialien, wie Ti, für Thrombose in einem großen Tier-Modell. Wir fanden, dass die Schweine dieses Verfahren gut vertragen und dass diese Implantation kann mit nur minimalem Blutverlust und ohne EPC Schicht Störungen erreicht werden. t "> Abbildung 7 zeigt, dass eine nackte Ti Rohr komplett verschließt, während unser EPC gesäumten Rohr bleibt Patent auch in der prothrombotischen geringer Scherung Umfeld der unteren Hohlvene. Darüber hinaus bestätigt das Vorhandensein einer konfluenten Schicht von fluoreszenzmarkierten Zellen der Erfolg dieser Methode, wie in Abbildung 8 dargestellt. Abbildung 1. Schematische Darstellung der autologen Endothelzellen Progenitorzellen (EPC) Seeding Experiment. Zunächst wird dem peripheren Blut von einem Schwein gezeichnet. Als nächstes sind EPCs aus dem Blut isoliert und in Kultur expandiert. EPCs werden dann verwendet, um eine Titan (Ti) Rohr-Gerät, die dann operativ in die untere Hohlvene aus dem gleichen Schwein, aus denen Zellen wurden isoliert implantierten Linie. Abbildung 2. Representative Kolonie von EPCs in Kultur, etwa 7 Tage nach der Isolierung Verfahren (abgebildet mit einer invertierten Leica DMIL Mikroskop mit Imaging-Kamera und QCapture Software). Abbildung 3. Ti Rohrabschnitte vor der Montage. Ti-Schlauch ist in 3 gleich große Abschnitte längs geschnitten und dann auf 4,5 cm Länge geschnitten. Innenflächen der Ti Abschnitte sind poliert mit einem Schleifbock und Schmirgelpapier zu sichtbaren Gruben zu entfernen. Abbildung 4. Montage von Ti Rohrabschnitte mit PVC Schrumpfschlauch (blau) und Heißluftpistole. Ti Abschnitte basieren auf einem gefrästen Aluminium Dorn, der durch Ti Abschnitte erweitert und entspricht den Abmessungen des Ti Rohrinnendurchmesser unterstützt. Abbildung 5 Titanium Rohr Montage, mit allen Komponenten:. Luer-Kappe, Spritze 'Kopfstück ", Silikonschlauch und Ti Rohr mit PVC wrap (blau). Die Montage erfolgt zusammen vor der Sterilisation für den chirurgischen Einsatz gebracht. Abbildung 6. Ti Rohr Aussaat Setup im Inkubator, zeigen Motor, Plattform, bearbeitetem Aluminium Spritzenhalter, Ti Tubus, und 5 ml-Spritze. Hinweis: Die Montage ist ohne schützende Hülle steril zur Visualisierung dargestellt. Abbildung 7. Representative grobe Ergebnisse der Implantation Chirurgie. (A) End-Sicht der Steuerung Bare-Metal-Ti Rohr nach der Implantation in porcine untere Hohlvene (IVC). Rohr Lumen ist voll ausgestattet mit einem festen Gerinnsel verstopft. (B) End-Sicht auf EPC-seeded Ti Rohr nach der Implantation. Rohr Lumen ist patentrechtlich umfassend und klar. (C) Dissected Hinblick auf die Kontrolle (bare) Ti Rohr nach 3 Tage Implantation, das Ausmaß der Thrombose (Experimente wurden bis zu 3 Wochen Dauer mit identischen Ergebnissen geführt). Abbildung 8. EPCs auf Ti Rohroberfläche folgenden 3 Tage Implantation (abgebildet mit einem aufrechten Leica DMRB Mikroskop mit einem QImaging QICAM monochrome Digitalkamera und Image Pro Plus-Software). (A) Confluent Zellen an der Oberfläche zeigt PKH26 vor der Operation Kennzeichnung. (B) konfluente Schicht von EPCs. Rot: PKH26 vor der Operation Kennzeichnung. Grün: EPC PECAM-Fleck.