Autologue de cellules progénitrices endothéliales-ensemencement de la technologie et les tests de biocompatibilité pour les appareils de cardio-vasculaires dans le modèle des grands animaux

1. Endothéliales progénitrices des cellules d'isolement Trente jours avant l'implantation du tube CBE graines, préparer une seringue de 60 ml avec 15 ml de solution de citrate dextrose anticoagulant et sécurisé avec un robinet d'arrêt à 3 voies pour l'isolement du EPC du sang de porc périphériques. 24 heures avant le prélèvement sanguin, précouche deux plaques de 12 puits avec du collagène de type 1 chez le rat (50 pg / ml, dissous dans 0,02 N solution d'acide acétique) 4. Effectuer toutes les soins aux animaux et à l'expérimentation en conformité avec l'Institut national de lignes directrices de Santé pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire et seulement après l'approbation de la protection des animaux et du Comité institutionnel superviser l'utilisation. Sedate une femelle Yorkshire de porc (45 kg) avec de l'acépromazine (1,1 mg / kg) et la kétamine (22 mg / kg) par voie intramusculaire par une aiguille 19 G papillon. Intuber le cochon avec un tube endotrachéal (30 cm de longueur, 8 mm de diamètre) et anesthésier cochon avec l'isoflurane (4,5% du volume courant par masque). Surveiller le cochon lors de la procédure par la mesure de la saturation en oxygène, la fréquence cardiaque et la température. Maintenir la thermorégulation en utilisant une table d'opération automatisée chauffée et une couverture de chauffage et par le réchauffement des fluides perfusé. Placer le porc dans la position couchée sur la table opératoire, sécuriser ses membres postérieurs caudolaterally, et propre à la chlorhexidine suivie par DuraPrep stérilisation. Puis procéder à draper la région pelvienne. Insérer une aiguille de 21 G x 7 cm à partir d'un micro-5 F introducteur kit juste en dedans de pouls palpable fémorale (en dedans de la vaste médial et latéral vers le muscle gracilis) dans la veine fémorale et cathétériser la veine à l'aide technique de Seldinger. Branchez le 60 seringues préparées ml au cathéter intravasculaire et tirer 45 ml de sang. Tenir la pression sur le site de ponction navire pour obtenir l'hémostase (5 min), arrêter l'anesthésie et de récupérer le cochon. L'animal est surveillé jusqu'à guérison complète et est retourné dans sa cage. Diluer la solution avec une solution de sang 01:01 Hank saline tamponnée (sans CaCl 2, MgCl 2, MgSO 4) et la couche sur les volumes égaux de Histopaque de créer des couches bien définies. Centrifugeuse de cellules (30 min, 740 g, la mise briser basse) et de recueillir des mononucléaires (MNC) couche. Resuspendre et laver les multinationales x 3 avec du phosphate de Dulbecco saline tamponnée (DPBS) (10 min, 515 g) avant plaquage en deux plaques de 12 puits dans un milieu de pleine croissance (EBM-2 moyennes avec 2% sérum porcin (PS) et EGM-2 SingleQuots) à 37 ° C, 5% de CO 2. Lentement changement de milieu toutes les 24 heures pendant les 7 premiers jours, puis tous les autres jours. Identifier les colonies CBE, après un temps moyen de 7 jours (figure 2). Développer EPC dans la culture une fois qu'ils couvrent ¼ de la superficie de 12 puits. Confirmer l'identité EPC avec la cytométrie de flux par des tests pour la présence de marqueurs de surface CD31 et l'absence de CD14, CD45. D'autres essais qui peuvent être effectués comprennent la morphologie cellulaire et de l'oxyde nitrique III activité après l'exposition au flux 4. 2. Tube de titane Section d'un tube Ti longitudinalement en trois égale à 120 degrés unités (4,5 cm de long) avec un 72 dents HHS fraise-scie maintenu en place par une tonnelle vu dans une machine de fraisage verticale. Lancez-le à 300 RPM et de garder la zone de coupe saturé de fluide de coupe du robinet magique à tout moment pendant la coupe (figure 3). Polonaise de la surface intérieure d'un touret et une roue métallurgie Scotch-Brite. Ensuite manuellement polir avec 3M d'une toile émeri à la surface encore lisse et même de supprimer tout fosses visibles. Nettoyer les pièces avec Ti Alconox solution savonneuse, suivi par 5 minutes de submersion dans l'eau régale (1:3 d'acide nitrique concentré à l'acide chlorhydrique concentré), suivi d'un rinçage avec plusieurs litres d'eau 10. Soyez prudent extrême que l'eau régale est très corrosif et potentiellement explosive! Soniquer sections Ti x 16 min dans du savon Alconox solution, élévation x 30 dans de l'eau déminéralisée et soniquer nouveau x 16 min dans de l'eau déminéralisée. Laisser sécher dans une hotte à flux laminaire. Couper en PVC gaine thermorétractable à 4,5 cm de longueur et nettoyer soigneusement par 2,4. Utilisez une pince à épiler pour placer les 3 sections nettoyées Ti sur un mandrin de soutien (usiné à partir d'aluminium, 8,5 mm de diamètre extérieur) et le manchon lieu de PVC gaine thermorétractable autour des sections Ti (figure 4). Gaine thermorétractable avec un pistolet thermique tout en tournant pour bien envelopper mandrin sections Ti étroitement ensemble. 3. Dispositif d'ensemencement et d'assemblage des composants Couper des tubes de silicone pour une longueur de 2,5 cm et 3,5 cm. Seringue en plastique cc section 5 à la marque de 0,8 ml et de garder «pièce de tête» avec embout Luer. Bien nettoyer 2 sections de silicone x, 'pièce de tête »seringue et un bouchon Luer par sonication comme décrit sous 2.4. Ajouter tube en silicone à chaque extrémité du tube à partir assemblés Ti 2.5, extensionDing de 5 mm sur le tube en PVC. Insérez l'extrémité coupée de la «pièce de tête» de la seringue dans tube en silicone courte, de sorte qu'il jouxte Ti tube (figure 5). Seal a terminé l'assemblage du tube Ti avec un bouchon luer dans une pochette en Tyvek et gaz stériliser à l'oxyde d'éthylène (18 heures à 55 ° C). Monter un moteur de synchronisation synchrone (10 RPH) sur une plateforme en plexiglas et de connecter son axe à un porte-seringue (usiné en aluminium, s'adapte seringue de 5 cc) (figure 6). 4. EPC-ensemencement de Ti surface intérieure du tube Développer EPC comme isolés sous 1. Confluentes à 3 flacons T-75 (ou au moins de 9 x 10 6 cellules). Le jour de la chirurgie, marquer les cellules par fluorescence à long terme de teinture (PKH26) 11. Commencez par rincer EPC cultivés deux fois dans un milieu sans sérum. Attention à limiter l'exposition de lumière pour protéger les cellules pendant et après l'étiquetage. Couverture des cellules avec 4 pM PKH26 dans le diluant C (solution de colorant) à température ambiante pendant 4 minutes. Arrêtez étiquetage réaction en ajoutant du sérum de porc dans un volume égal à teindre solution. Une minute plus tard, une solution diluée 1:1 avec combinée milieu de croissance complet. Aspirer le liquide et rincer les cellules x 3 avec support pleine croissance. Laver deux fois dans DPBS EPC (sans CaCl 2, MgCl 2). Couverture des cellules dans la trypsine et incuber à 37 ° C pendant 3 minutes et confirmer le détachement sous un microscope optique. Ajouter la solution de neutralisation de la trypsine du double du volume de la trypsine utilisée. Combinez des solutions cellulaires dans un seul tube et mélanger par pipetage. Ajouter 10 ul d'une solution de cellules dans chaque côté d'un hémocytomètre pour le comptage. Solution cellulaire Centrifugeuse (1500 RPH, à 5 min.). Compter les cellules et resuspendre granulés à 2 – 2,5 x 10 6 EPC / ml dans un milieu sans sérum. Notez le volume minimum pour remplir le tube est de 4,5 ml. Disposez une serviette stérile hotte biologique pour le champ stérile. Ouvrez gaz stérilisée tube Ti et extra seringue de 5 cc sur un champ stérile. Avec des gants stériles, retirer le piston de seringue de 5 cc et de garder sur le terrain pour une utilisation ultérieure. Apposez Luer bouchon à cette seringue. Pipet les 4,5 – 5 ml suspension en vertu du CBE 4.9 dans la seringue ouverte. Insérez le piston solidement retour dans l'extrémité ouverte de la seringue. Tenez la seringue avec bouchon vers le haut et retirez le capuchon. Insérer la seringue avec embout Luer première dans des tubes en silicone ouverte tube Ti jusqu'au serré, ne pas avancer dans le tube Ti. Seringue Advance plongeur lentement jusqu'à ce que la solution cellulaire atteint haut de la seringue coupé "pièce de tête,« éliminer les bulles du système. Fermer avec bouchon Luer et insérez assemblée entière dans la gaine stérile, étanchéité extrémité ouverte avec du ruban adhésif. Insérez cette assemblée entière en porte-seringue usiné de 3,7. Placer dans un incubateur à 37 ° C et ajuster la plate-forme de telle sorte que partie de tube Ti de la chambre de semis est de niveau, utilisant l'indicateur de niveau d'eau (figure 6). Autoriser tube Ti pour tourner 30 minutes avant l'implantation. 5. Implantation de Ti tube dans la veine cave inférieure porcine Vingt-quatre heures avant la chirurgie, le cochon prémédication (à partir de laquelle ont été isolés EPC) avec un patch de fentanyl (100 pg / hr transdermique; garder timbre en place x 72 heures). Gardez cochon NPO nuit et administrer Baytril (enrofloxacine) en préopératoire à la journée de la chirurgie (5 mg / kg, IM) et pour 7 jours suivants, toutes les 24 heures en tant que prophylaxie antibiotique. Sedate, intuber et anesthésier le porc comme décrit sous 1.3 (volume courant de 10 -15 ml / kg) et sécuriser le cochon dans la position couchée sur la table de salle d'opération. Surveiller le cochon lors de la procédure par la mesure de la saturation en oxygène, la fréquence cardiaque et la température. Maintenir la thermorégulation en utilisant une table d'opération automatisée chauffée et une couverture de chauffage et par le réchauffement des fluides perfusé. Insérer une 18 G IV cathéter dans la veine d'oreille de porc et de protéger les yeux de cochon avec des gouttes oculaires Vetropolycin. Nettoyer, préparer et drapé abdomen du porc comme dans 1.6. Inciser la ligne médiane avec une lame de bistouri n ° 15 de la 2e série de glandes mammaires crânialement à la 2e à la dernière mis caudalement. Réaliser la dissection jusqu'à l'aponévrose abdominale avec électrocoagulation. Soulevez le péritoine avec une pince Mosquito et soigneusement avec des ciseaux entrent Metzenbaum. Externaliser la vessie et place d'un 3-O Vicryl bourse chaîne de suture dans la paroi vésicale. Placez une incision dans son milieu et insérer une sonde de Foley 16 F. Administrer des fluides par voie intraveineuse (Ringer lactate) pour titrer la production d'urine à> / = 1 ml / kg / h pendant la chirurgie. Après, externaliser l'intestin grêle et grandes entreprises et placer deux écarteurs chirurgicaux Balfour pour exposer la face postérieure de la cavité péritonéale et d'identifier la veine cave inférieure (VCI). Utiliser dissection fine et contondants, soigneusement sans la VCI à partir des tissus environnants et squelettisent le navire de l'artère rénale proximale de la bifurcation de l'extrémité distale IVC. Faire extrêmement attention lors de la dissection IVC que même un défaut très faible dans la VCI peut conduire à une hémorragie rapide et exsanguination de l'animal. Ligaturer toutes les branches latérales du segment IVC pour assurer qu'il n'y aura pas de saignement autour du tube Ti pour être implantés. Notez les deux grandes généralement postérieure veines lombaires qui nécessitent une dissection très prudent et de ligature. En outre, notez que, immédiatement en amont de la bifurcation de la VCI, une grosse veine lombaire est fréquemment rencontrés sur le côté postéro-interne et doit être disséqué et contrôlée avec des boucles navire en préparation pour le placement de serrage. Procéder à l'ensemencement du tube Ti simultanément comme indiqué au paragraphe 4. Administrer 100 USP / kg d'héparine immédiatement avant serrage de la VCI. Placer 45 pinces angle de degré chirurgicales distalement sur la VCI et la veine lombaire, puis proximalement. Créer un veinotomy longitudinales (4 cm) entre les brides proximales et distales à l'aide d'une lame de bistouri n ° 11 puis, par extension, avec des ciseaux de Potts. Evacuer toute de sang de la veine cave inférieure et rincer sa lumière intérieure avec DPBS stérile. Maintenant, insérez le CPE-ensemencé Ti tube (ou un contrôle en métal nu) dans la VCI et le remplir avec du DPBS (avec CaCl 2, MgCl 2) pour empêcher les cellules de séchage et d'évacuer l'air. Fermez le veinotomy avec une suture Prolène 4-0 course et enlever un clamp proximal à de l'air grâce à la VCI une petite quantité de back-saignements. Placez un "séjour de suture" à travers la paroi de la veine dans le tube en PVC pour empêcher la migration de l'implant avec le temps. Fermer l'aponévrose avec un O-PDS sur une aiguille CT et l'espace sous-cutanée avec 2-O Vicryl (course sutures). Fermer la peau avec des agrafes. Administrer à 20 ml de marcaïne 0,25% (bupivacaïne) sous-cutanée le long du site d'incision et de recouvrir la plaie avec de la gaze et Tegaderm. Donnez aussi Flunixine (2,2 mg / kg Q 24 h) et oxymorphone (0,15 mg / kg Q 3 – 4 heures) sous-cutanée au besoin pour la douleur. Cesser d'anesthésie, de surveiller le porc jusqu'à ce éveillé et retour à la cage. Moniteur de porc deux fois par jour pour des signes de détresse / douleur, debout et la marche, les selles et la production d'urine, et la couleur de peau indiquant perfusion normale. 6. Explantation de Ti tubes Après 3 semaines, calme, intuber et anesthésier le porc comme décrit au paragraphe 1.3 – 1.4. Procéder à une laparotomie comme décrit dans 05/05 au 05/08. Notez que la cicatrisation se dissimuler le site de l'implant, mais vous pouvez palper le tube rigide Ti in situ. Disséquer la VCI comme décrit dans 5.9 à 5.11 et le tube Ti explant en-bloc avec l'entourant avec des ciseaux IVC lourds. Euthanasier l'animal avec une solution d'euthanasie Euthasol (390 mg / ml de pentobarbital de sodium et 50 mg / ml phénytoïne sodique à 1 ml / 10 lb). 7. Fixation et imagerie Ti surface intérieure Rincez le segment de veine excisée avec tube Ti dans une solution de DPBS et de photographier sa lumière (brevet ou occlus) avec un appareil photo numérique haute résolution (figure 7). Après, fixer le spécimen à l'immerger dans paraformaldéhyde 3,7% pour un minimum de 15 minutes. Rincez spécimen en solution DPBS. Très soigneusement inciser la veine environnantes et tuyaux en PVC d'ouvrir le tube Ti. Placer les 3 sections sous un microscope à fluorescence avec les surfaces intérieures face à l'objectif / source de lumière et de l'image sous 550 nm de longueur d'onde d'excitation de visualiser PKH26 marqué EPC en rouge / orange (figure 8A). Si désiré, les cellules peuvent être encore tachées (par exemple des plaquettes marqueur endothélial adhésion cellulaire (PECAM)-coloration de visualiser les bordures de cellule (figure 8B), DAPI-taches de visualiser les noyaux, etc.) 8. Les résultats représentatifs: Après l'exécution de ce protocole, les médecins et les scientifiques sont capables de endothelialize structures tube solide avec des dérivés du sang autologue les cellules progénitrices endothéliales dans un modèle de grand animal. La figure 2 montre que les PEC isolés avec notre méthode apparaissent comme des colonies de morphologie pavées après environ 7 jours à de la culture. Notre dispositif d'ensemencement illustré dans les figures 5 et 6 permet une rotation lente de tubes remplis de Ti avec la suspension CBE et les résultats dans une couverture uniforme de la surface intérieure du tube dans des conditions stériles 9. Notre chirurgie d'implantation permet de tester la propension des biomatériaux, tels que Ti, de la thrombose dans un modèle de grand animal. Nous avons trouvé que les porcs tolèrent cette procédure bien et que cette implantation peut être atteint avec seulement une perte de sang minime et sans interruption de la couche CBE. t "> La figure 7 montre que le tube nu Ti obstrue complètement, alors que notre EPC-alignés tube reste de brevet, même dans l'environnement à faible cisaillement prothrombotique de la veine cave inférieure. De plus, la présence d'une couche confluente de cellules marqué par fluorescence confirme le succès de cette méthode comme le montre la Figure 8. Figure 1. Schéma de l'autogreffe de cellules progénitrices endothéliales expérience d'ensemencement (CPE). Tout d'abord, le sang périphérique est tiré d'un cochon. Ensuite, EPC sont isolés du sang et multipliées en culture. EPC sont ensuite utilisés pour la ligne un dispositif de titane tube (Ti), qui est ensuite implanté chirurgicalement dans la veine cave inférieure du même porc à partir de laquelle les cellules ont été isolées. Figure 2. Colonie Représentant des EPC dans la culture, à environ 7 jours après la procédure d'isolement (imagé avec un microscope inversé Leica DMIL avec l'imagerie par caméra et un logiciel QCapture). Figure 3. Sections de tube Ti avant l'assemblage. Tube Ti est découpé en trois sections égales longitudinalement, puis couper à 4,5 cm de longueur. Surfaces intérieures des sections Ti sont polis en utilisant une meuleuse d'établi et de toile émeri pour enlever les noyaux visibles. Figure 4. Assemblée des sections de tube PVC Ti avec gaine thermorétractable (bleu) et un pistolet thermique. Ti sections sont appuyés sur un mandrin en aluminium usiné qui s'étend à travers des sections Ti et correspond aux dimensions du diamètre du tube Ti intérieure. Figure 5 tube en titane, en montrant tous les composants:. Luer casquette, «pièce de tête,« seringue tube en silicone, et un tube de PVC Ti wrap (bleu). Assemblée est mis en place avant la stérilisation à usage chirurgical. Figure 6. Setup Ti ensemencement tube intérieur incubateur, montrant à moteur, plateforme, porte-seringue usinées en aluminium, tube Ti, et 5 seringues cc. Remarque: l'Assemblée est montré sans gaine protectrice stérile à des fins de visualisation. Figure 7. Représentant résultats bruts de la chirurgie d'implantation. (A) Fin-vue du contrôle strict tube métallique Ti après l'implantation dans porcine veine cave inférieure (VCI). Tube lumière est complètement obstruée par un caillot solide. (B) Fin de vue de l'EPC-ensemencé le tube Ti après l'implantation. Tube lumière est entièrement brevets et clair. (C) Vue disséquées de contrôle (à nu) du tube Ti après l'implantation de 3 jours, montrant l'étendue de la thrombose (expériences ont été menées durée allant jusqu'à 3 semaines avec des résultats identiques). EPC Figure 8. Sur la surface du tube Ti après l'implantation 3 jours (imagées avec un microscope droit Leica DMRB avec un QICAM QImaging monochrome appareil photo numérique et Pro Image Plus de logiciels). (A) Les cellules confluentes sur la surface montrant PKH26 pré-chirurgie étiquetage. (B) couche confluente de CPE. Rouge: PKH26 pré-chirurgie étiquetage. Vert: CBE PECAM-tache.