Autologe endotheliale voorlopercellen-zaaien Technologie en biocompatibiliteitstests voor cardiovasculaire apparaten in grote Animal Model

1. Endotheliale voorlopercellen geïsoleerd Dertig dagen voorafgaand aan de EPC-geplaatste buis implantatie, bereiden een 60 ml spuit met 15 ml van anti-stollingsmiddel citraat dextroseoplossing en veilig met een 3-weg afsluiter voor de EPC-isolatie van perifere bloed van varkens. 24 uur voor het bloed te trekken, voorstrijken twee 12-wells-platen met Type 1 rat collageen (50 ug / ml, opgelost in 0,02 N azijnzuur) 4. Gedragsregels alle dierlijke zorg en experimenten in overeenstemming met de National Institute of Health Richtlijnen voor de Zorg en gebruik van proefdieren en pas na goedkeuring van het toezicht op Institutional Animal Care en gebruik Comite. Rustig een vrouwelijke Yorkshire varken (45 kg) met Acepromazine (1,1 mg / kg) en ketamine (22 mg / kg) intramusculair via een 19 G vlinder naald. Intuberen het varken met een endotracheale tube (30 cm lang, 8 mm ID) en het verdoven varken met Isofluraan (4,5% van het tidal volume door masker). Monitor het varken tijdens de procedure door het meten van de zuurstofverzadiging, hartslag en temperatuur. Onderhouden thermoregulatie met behulp van een geautomatiseerd verwarmde operatietafel en verwarming deken en door de opwarming van de toegediende vloeistoffen. Plaats het varken in de rugligging op de operatietafel, caudolaterally veilig zijn achterpoten, en schoon met Chloorhexidine, gevolgd door DuraPrep sterilisatie. Ga dan verder met draperen het bekkengebied. Plaats een 21 G x 7 cm naald uit een 5 F micro-introducer kit alleen maar mediaal naar een tastbare femorale pols (mediaal van de vastus medialis en lateraal van de gracilis spier) in de lies en de canule de ader met behulp van Seldinger techniek. Sluit de voorbereide 60 ml spuit met de intravasculaire katheter en trekken 45 ml bloed. Houd de druk op het schip prikplaats om hemostase (5 min) te bereiken, stoppen met de anesthesie en herstellen van de varken. Het dier is gecontroleerd tot volledig herstel en keerde terug naar zijn kooi. Het bloed verdunnen oplossing 1:1 met gebufferde zoutoplossing Hank's (zonder CaCl2, MgCl2, MgSO 4) en laag op gelijke volumes van Histopaque om goed gedefinieerde lagen te creëren. Centrifuge (30 min, 740 g, lage break-instelling) en het verzamelen van mononucleaire cellen (MNC) laag. Resuspendeer en was MNC x 3 met fosfaat Dulbecco's gebufferde fysiologische zoutoplossing (DPBS) (10 min, 515 g) voor het uitplaten in twee 12-wells platen in volle groei medium (EBM-2 medium met 2% Varkens Serum (PS) en EGM-2 SingleQuots) bij 37 ° C, 5% CO 2. Langzaam veranderen medium elke 24 uur gedurende de eerste 7 dagen, daarna om de andere dag. Identificeer EPC kolonies na een gemiddelde tijd van 7 dagen (figuur 2). Uit te breiden EPC's in de cultuur als zij betrekking hebben ¼ van de 12-well oppervlakte. Bevestig EPC identiteit met flowcytometrie door het testen op de aanwezigheid van oppervlakte markers CD31 en de afwezigheid van CD14, CD45. Andere testen die uitgevoerd kunnen worden zijn onder celmorfologie en stikstofmonoxide III-activiteit na blootstelling aan vier stromen. 2. Titanium buis montage Sectie een Ti buis lengte in 3 gelijke 120-graden-eenheden (4,5 cm lang) met een 72 tanden HHS snijden zag zijn plaats gehouden door een zaag prieel in een verticale freesmachine. Run it op 300 RPM en houd het snijden gebied verzadigd is met Tap Magic snijvloeistof te allen tijde tijdens het snijden (figuur 3). Polijst de binnenzijde met een bankje molen en een Scotch-Brite metaalbewerking wiel. Vervolgens handmatig polijsten met 3M schuurlinnen verder te glad en zelfs oppervlak zichtbare kuilen te verwijderen. Reinig de Ti stukken met Alconox zeepoplossing, gevolgd door 5 minuten onderdompeling in aqua regia (1:3 geconcentreerd salpeterzuur tegen geconcentreerd zoutzuur), gevolgd door spoelen met meerdere liters water 10. Wees uiterst voorzichtig als koningswater is zeer corrosief en explosiegevaarlijke! Ultrasone trillingen Ti secties x 16 min in Alconox zeepoplossing, stijging van 30 x in gedeïoniseerd water en ultrasone trillingen weer x 16 min in gedeïoniseerd water. Laten drogen in laminaire flow kap. Gesneden PVC warmte-shrink tubing tot 4,5 cm lang en grondig reinigen per 2,4. Gebruik een pincet om de drie schoongemaakt Ti secties plaatsen op een ondersteunende doorn (vervaardigd uit aluminium, 8,5 mm OD) en plaats mouw van PVC warmte-krimpkous rond Ti secties (figuur 4). Shrink buis met een warmte kanon terwijl u doorn gelijkmatig te wikkelen Ti delen stevig tegen elkaar. 3. Seeding apparaat en de assemblage van componenten Gesneden silicone tot een lengte van 2,5 cm en 3,5 cm. Hoofdstuk 5 cc plastic spuit op de 0,8 ml markering en houdt 'hoofd stuk' met luer einde. Grondig reinigen 2 x silicone delen, spuit 'hoofd piece' en een luer-cap met het ultrasoonapparaat zoals beschreven onder 2.4. Voeg silicone aan elk uiteinde van geassembleerde Ti buis van 2,5, extending met 5 mm meer dan PVC-buis. Steek afgesneden uiteinde van de spuit 'head piece' in korte silicone, zodat hij Ti buis (figuur 5) grenst. Seal klaar Ti buis montage met een luer-cap in Tyvek zakje en gas-steriliseren met ethyleenoxide (18 uur bij 55 ° C). Monteer een synchrone timing motor (10 RPH) op een platform plexiglas en sluit de as met een injectiespuit houder (gefreesd uit aluminium, past op 5 cc injectiespuit) (Figuur 6). 4. EPC-zaaien van Ti buis inwendig oppervlak Uit te breiden EPC's als op zichzelf staande onder 1. Tot en met 3 samenvloeiende T-75 flessen (of op zijn minst 9 x 10 6 cellen). Op de dag van de operatie, fluorescent label cellen met de lange termijn kleurstof (PKH26) 11. Begin met het spoelen gekweekt EPC's twee keer in serum vrij medium. Voorzichtigheid aan blootstelling aan licht te beperken tot cellen te beschermen tijdens en na de etikettering. Bedek cellen met 4 uM PKH26 in Diluent C (kleurstof oplossing) bij kamertemperatuur gedurende 4 minuten. Stop labeling reactie door het toevoegen van varkens serum in gelijke volume om de oplossing te verven. Een min later, verdun gecombineerde oplossing 1:1 met volle groei medium. Aspireren vloeistof en spoel cellen x 3 met volle groei medium. Was EPC's tweemaal in DPBS (zonder CaCl2, MgCl2). Cover cellen in trypsine en incubeer bij 37 ° C gedurende 3 minuten in en bevestig detachement onder een lichtmicroscoop. Voeg Trypsine Neutralisatie Oplossing in dubbele van het volume van trypsine gebruikt. Combineer cel oplossingen in een enkele buis en meng door pipetteren. Voeg 10 ul van cel oplossing in elke zijde van een hemocytometer voor het tellen. Centrifuge cel-oplossing (1500 RPH, 5 min.).. Tellen cellen en resuspendeer pellet bij 2 – 2,5 x 10 6 EPC / ml in serum vrij medium. Let op de minimale volume op te vullen van de binnenband is 4,5 ml. Lay-out steriele handdoek in de biologische kap voor steriele veld. Open gas-gesteriliseerde Ti buis montage en extra 5 cc spuit op steriele veld. Met steriele handschoenen, verwijder plunjer van 5 cc spuit en blijf op het veld voor later gebruik. Bevestig luer-dop aan deze spuit. Pipet de 4,5 – 5 ml EPC opschorting op grond van 4.9 in het open spuit. Plaats de zuiger stevig terug in het open uiteinde van de spuit. Houd spuit met dop naar boven en verwijder dop. Plaats de spuit met luer-uiteinde eerst in de open silicone van Ti binnenband totdat deze goed vastzit, niet vooraf binnen de Ti buis. Advance zuiger van de spuit langzaam tot cel-oplossing bereikt top van de snede spuit 'hoofd stuk,' het verwijderen van luchtbellen uit het systeem. Sluit af met luer-dop en steek gehele assemblage in steriele schede, afdichten van open einde met tape. Plaats deze hele constructie in machinaal spuithouder van 3,7. Plaats in de incubator bij 37 ° C en aan te passen platform, zodat Ti buis deel van zaaien kamer is vlak, met behulp van peilglas (Figuur 6). Laat Ti buis montage tot 30 minuten te draaien voor implantatie. 5. Implantatie van Ti buis in varkens vena cava inferior Vierentwintig uur voor de ingreep, premedicate het varken (waarvan EPC's werden geïsoleerd) met een Fentanyl patch (100 ug / uur transdermale; houden pleister op zijn plaats x 72 uur). Houd varken NPO 's nachts en preoperatief toedienen Baytril (Enrofloxacine) op de dag van de operatie (5 mg / kg, IM) en voor 7 dagen na, elke 24 uur als antimicrobiële profylaxe. Bezadigde, intuberen en verdoven het varken zoals beschreven onder 1.3 (ademvolume van 10 -15 ml / kg) en zet het varken in rugligging op de operatietafel kamer tafel. Monitor het varken tijdens de procedure door het meten van de zuurstofverzadiging, hartslag en temperatuur. Onderhouden thermoregulatie met behulp van een geautomatiseerd verwarmde operatietafel en verwarming deken en door de opwarming van de toegediende vloeistoffen. Plaats een 18 G IV katheter in het oor van het varken ader en beschermen varken ogen met Vetropolycin oogdruppels. Schoon, prep en drapeer het varken buik als in 1.6. Incise de middellijn met een # 15 scalpel vanaf de 2e set van de borstklieren craniaal naar de 2e naar caudaal laatste set. Draag de dissectie tot op de buik frieslijst met elektrocauterisatie. Til het buikvlies met Mosquito tang, en voorzichtig te gaan met Metzenbaum schaar. Externaliseren van de urineblaas en plaats een 3-O Vicryl portemonnee-string hechting in de blaaswand. Plaats een steek incisie in het midden en plaats een 16 F Foley katheter. Dien intraveneuze vloeistoffen (lactaat Ringers) om de urineproductie te titreren naar> / = 1 ml / kg / uur tijdens de operatie. Na, externaliseren de kleine en dikke darm en plaats twee Balfour chirurgische retractors naar het achterste deel van de buikholte bloot te leggen en identificeren van de vena cava inferior (IVC). Met behulp van scherpe en stompe dissectie, zorgvuldig vrij van de IVC uit de omliggende weefsel en skelet worden het schip van de rechter nierslagader proximaal van de splitsing van het IVC distale. Wees uiterst voorzichtig tijdens het IVC dissectie als zelfs maar een heel klein defect in de IVC kan leiden tot een snelle bloeding en verbloeding van het dier. Afbinden alle zijtakken van het IVC-segment om ervoor te zorgen dat er geen bloeden rond de Ti buis te worden ingeplant worden. Let op de meestal grote twee posterieure lumbale aders die zeer zorgvuldige dissectie en ligatie vereisen. Verder rekening mee dat onmiddellijk proximaal van de splitsing van het IVC, een grote lumbale ader vaak wordt aangetroffen op de posteromediale kant en moeten worden ontleed vrij en gecontroleerd met schip lussen in voorbereiding op de klem plaatsing. Ga verder met zaaien de Ti buis tegelijkertijd als beschreven onder 4. Dien 100 USP / kg van heparine onmiddellijk voorafgaand aan het inklemmen van de IVC. Plaats hoek van 45 graden chirurgische klemmen distaal op de IVC en lumbale ader, en dan proximaal. Maak een longitudinale veinotomy (4 cm) tussen de proximale en distale klemmen met behulp van een # 11 scalpel gevolgd door een extensie met Potts schaar. Evacueren geen bloed uit het IVC en spoel het binnenste lumen met een steriele DPBS. Steek nu de EPC-geplaatste Ti buis (of een bare metal controle) in het IVC en vul deze met DPBS (met CaCl2, MgCl 2) om de cellen uitdrogen te voorkomen en om de lucht te evacueren. Sluit de veinotomy met een 4-0 Prolene loopt hechtingen te verwijderen en een proximaal klem om de-lucht de IVC door middel van een kleine hoeveelheid van de back-bloeden. Plaats een 'stay-hechting' door de ader wand in de PVC-buis op migratie van implantaat te voorkomen dat na verloop van tijd. Sluit de frieslijst met O-PDS op een CT naald en de subcutane ruimte met 2-O Vicryl (lopen hechtingen). Sluit de huid met nietjes. Dien tot 20 ml van 0,25% Marcaine (Bupivacaïne) subcutaan langs de incisie en bedek de wond met gaas en Tegaderm. Geef ook Flunixine (2,2 mg / kg Q 24 uur) en oxymorfon (0,15 mg / kg Q 3-4 uur) subcutaan, als die nodig zijn voor pijn. Stop met verdoving, monitor het varken tot wakker en terug te keren naar kooi. Monitor varken tweemaal daags voor tekenen van angst / pijn, staan ​​en het lopen, ontlasting en urine-output, en huidskleur geven normaal perfusie. 6. Explantatie van Ti buis Na 3 weken, bezadigd, intuberen en verdoven het varken, zoals beschreven in 1.3 – 1.4. Ga verder met een laparotomie, zoals beschreven in 5,5 tot 5,8. Merk op dat littekens zal het implantaat te verbergen, maar u kunt de starre Ti buis palperen in situ. Ontleden de IVC, zoals beschreven in 5,9 tot 5,11 en Explantatie de Ti buis en-blok met de omliggende IVC met zware schaar. Euthanaseren het dier met Euthasol euthanasie-oplossing (390 mg / ml pentobarbital Natrium en 50 mg / ml Fenytoïne Natrium bij 1 ml / 10 kg). 7. Fixatie en imaging Ti binnenkant Spoel de weggesneden ader segment met Ti buis in DPBS oplossing en foto's zijn lumen (octrooi of afgesloten) met een hoge resolutie digitale camera (figuur 7). Na, fix het analysemonster berekenen door onderdompeling in 3,7% paraformaldehyde voor een minimum van 15 minuten. Spoel exemplaar in DPBS oplossing. Heel voorzichtig incise de omliggende ader en PVC-slang aan de Ti buis te openen. Plaats de 3 secties onder een fluorescentiemicroscoop met de binnenkant naar de doelstelling / lichtbron en beeld minder dan 550 nm excitatie golflengte PKH26-gelabeld EPC's te visualiseren in het rood / oranje kleur (Figuur 8A). Indien gewenst, kunnen cellen worden verder gekleurd (bv. bloedplaatjes endotheliale Celadhesie Marker (PECAM)-vlek celranden (Figuur 8B), DAPI-vlek kernen te visualiseren, etc. visualiseren). 8. Representatieve resultaten: Na uitvoering van dit protocol, artsen en wetenschappers zijn in staat om stevige buis structuren endothelialize met autologe op basis van bloed endotheliale progenitor cellen in een groot dier model. Figuur 2 blijkt dat EPC's geïsoleerd met onze methode als kolonies met kinderkopjes morfologie verschijnen na ongeveer 7 dagen in cultuur. Onze zaaien apparaat geïllustreerd in figuren 5 en 6 zorgt voor trage rotatie van Ti buizen gevuld met de EPC vering en resulteert in een uniforme dekking van de innerlijke van de buis oppervlak van onder steriele omstandigheden 9. Onze implantatie chirurgie zorgt voor het testen van de neiging van biomaterialen, zoals Ti, voor trombose in een groot dier model. We vonden dat de varkens deze procedure goed verdragen en dat dit implantatie kan worden bereikt met slechts minimale bloedverlies en zonder EPC laag verstoring. t "> Figuur 7 laat zien dat een kale Ti buis volledig afsluit, terwijl onze EPC-gevoerde buis blijft octrooi, zelfs in de protrombotische lage afschuiving omgeving van de vena cava inferior. Verder is de aanwezigheid van een confluente laag van fluorescent gelabelde cellen bevestigt de succes van deze methode, zoals weergegeven in figuur 8. Figuur 1. Schema van autologe endotheliale voorlopercellen (EPC) zaaien experiment. Ten eerste is het perifere bloed getrokken uit een varken. Vervolgens worden EPC's geïsoleerd uit het bloed en uitgebreid in cultuur. EPC's worden vervolgens gebruikt om een ​​titanium (Ti) buis apparaat, dat vervolgens operatief wordt geïmplanteerd in de vena cava inferior van hetzelfde varken waaruit cellen werden geïsoleerd lijn. Figuur 2. Vertegenwoordiger kolonie van EPC's in de cultuur, van ongeveer 7 dagen na isolatie procedure (afgebeeld met een omgekeerde Leica DMIL microscoop met Imaging camera en QCapture software). Figuur 3. Ti buissecties voorafgaand aan de montage. Ti slang is gesneden in drie gelijke delen lengterichting en snijd tot 4,5 cm lengte. Binnenzijde van Ti secties zijn gepolijst met behulp van een bankje molen en schuurlinnen tot zichtbare kuilen te verwijderen. Figuur 4. Montage van Ti buis secties met PVC warmte-shrink tubing (blauw) en warmte kanon. Ti secties worden ondersteund op een bewerkte aluminium doorn die zich uitstrekt door Ti secties en komt overeen met de afmetingen van de Ti buis binnendiameter. Figuur 5 Titanium buis montage, waarin alle onderdelen:. Luer cap, spuit 'hoofd stuk,' siliconen slangen, en Ti buis met PVC-wrap (blauw). De montage is bij elkaar voorafgaand aan de sterilisatie opgemaakt voor chirurgisch gebruik. Figuur 6. Ti buis zaaien setup binnen couveuse, waarin motor, platform, gefreesd aluminium spuithouder, Ti buis montage, en 5 cc spuit. Opmerking: De montage is weergegeven zonder beschermende steriele schede voor visualisatie doeleinden. Figuur 7. Vertegenwoordiger bruto resultaat van implantatie chirurgie. (A) End-view van controle bare metal Ti buis na implantatie in varkens vena cava inferior (IVC). Tube lumen is volledig afgesloten met een stevig stolsel. (B) End-view van de EPC-geplaatste Ti buis na de implantatie. Tube lumen is volledig patent en duidelijk. (C) ontleed weergave van het (naakte) Ti buis na drie dagen implantatie, waarin de omvang van trombose (experimenten werden uitgevoerd tot 3 weken duurden met identieke resultaten). Figuur 8. EPC's op Ti buisoppervlak volgende drie dagen implantatie (afgebeeld met een rechtopstaande Leica DMRB microscoop met een QImaging QICAM monochrome digitale camera en Image Pro Plus software). (A) Confluente cellen op het oppervlak met PKH26 pre-operatie labeling. (B) Confluente laag van EPC's. Rood: PKH26 pre-operatie labeling. Groen: EPC PECAM-vlek.