غشائي ذاتي السلف الخلوي البذر التكنولوجيا واختبار توافق مع الحياة للحصول على أجهزة القلب والأوعية الدموية في نموذج حيواني كبير
Summary
وهناك طريقة لزرع التيتانيوم الدم بالاتصال مع الخلايا الحيوية ذاتي واختبار توافق مع الحياة الموصوفة. يستخدم هذا الأسلوب الخلايا البطانية السلف ومواسير والتيتانيوم ، والمصنفة في غضون دقائق من الزراعة الجراحية في الخنزيري الوريد الأجوف. هذا الأسلوب هو زرع أجهزة للتكيف مع العديد من الطب الحيوي.
Abstract
يتم تصنيع أجهزة القلب والأوعية الدموية التي تزرع في الجسم من المواد الاصطناعية (مثل التيتانيوم (تي) ، وسعت بولي تترافلوروإيثيلين) ، والتي تشكل خطر تشكيل thromboemboli 1،2،3. طورنا طريقة لخط السطح داخل الأنابيب مع ذاتي تي المشتقة من الدم البشري الخنزيري أو الخلايا البطانية السلف (EPCs) 4. من خلال زرع أنابيب تي تحتوي على طبقة من متموجة EPCs الخنازير في الوريد الأجوف السفلي (IVC) للخنازير ، ونحن اختبار للتوافق مع الحياة أفضل للسطح الخلية المصنفة في البيئة التخثر نموذج الحيوانات الكبيرة ومقارنته معدلة السطوح المعدنية العارية 5،6،7 (الشكل 1). ويمكن استخدام هذا الأسلوب لendothelialize الأجهزة في غضون دقائق من زرع واختبار وظائفها جرعات في الجسم الحي.
تم الحصول على الدم المحيطي من 50 كلغ يوركشاير الخنازير وكسر في الخلية وحيدة النواة مثقف لعزل EPCs 4،8. وكانت منظمة الشفافية الدولية أنابيب (9.4 ملم معرف) قبل قطع إلى ثلاثة أقسام الطول 4.5 الطولية وتجميعها مع الحرارة تنكمش الأنابيب. بنيت جهاز البذر ، والذي يسمح للدوران بطيء للأنابيب تي.
أداء لدينا البطن على الخنازير وتخريجها في الأمعاء والمثانة البولية. وقد استخدم تشريح حادة وصريحة لأصبح هيكل في IVC من التشعب لها القاصي إلى الشريان الكلوي الحق القريبة. ثم امتلأت أنابيب تي مع fluorescently المسمى ذاتي تعليق EPC وتناوب في 10 دقيقة و 30 RPH x لتحقيق موحدة الخلية طلاء 9. بعد إعطاء الهيبارين USP / 100 كجم ، وفرضت طرفي IVC والوريد القطني. وأجري veinotomy 4 سم وإدراج الجهاز ومليئة الفوسفات مخزنة المالحة. كما تم إغلاق veinotomy مع خياطة Prolene 4-0 على التوالي ، وكان لإزالة واحد المشبك IVC دي الهواء. إغلاق الفضاء تحت الجلد في نهاية هذا الإجراء ، وكان يقترب من لفافة مع PDS – 0 (polydioxanone خياطة) ، مع Vicryl 2-0 والجلد تدبيس مغلقة.
بعد 3-21 أيام ، وكان الموت الرحيم الخنازير ، الجهاز explanted ان كتلة والثابتة. وكانت مفككة تي أنابيب والأسطح الداخلية المصورة مع المجهر الفلورسنت.
وجدنا أن أنابيب معدنية عارية تماما في حين تي المغطي الأنابيب EPC المصنفة بقيت البراءة. علاوة على ذلك ، كنا قادرين على إثبات وجود طبقة من EPCs متكدسة على سطح الدم بالاتصال الداخل.
الختامية ، ويمكن استخدام التكنولوجيا لدينا لendothelialize أنابيب تي في غضون دقائق من زرع EPCs مع ذاتي لمنع تجلط الدم من الجهاز. الأسلوب الجراحي يسمح لنا لاختبار توافق مع الحياة وتحسين مثل هذه الأجهزة مع تعديل الحد الأدنى من فقدان الدم واضطراب EPC المصنفة السطح.
Protocol
Discussion
طريقة أنابيب تي خلية بذر المعروضة هنا تمكن الأطباء والعلماء بسرعة وبشكل موحد endothelialize الدم الاتصال أسطح الأجهزة التي تزرع في الجسم. منذ أن عزل وتوسيع EPCs عينات من الدم المحيطي ، لا يلزم إجراء الغازية الرئيسية لحصاد هذه الخلايا. علاوة على ذلك ، EPCs هي ذاتي ، وبالتالي يتم القضاء على خطر من أي رد فعل جهاز المناعة لزرع الخلايا المصنف. ويمكن استخدام المبادئ تظاهروا في البروتوكول له ليس فقط لأنابيب تي ، ولكن لالحيوية الأخرى الكثيرة التي تستخدم في مجال الطب القلب والأوعية الدموية.
خطوات حاسمة في هذا البروتوكول والتنظيف الدقيق للأنابيب تي ، كما وجدنا أن أي فيلم ملتصق من الملوثات التقيد الخلية تنازلات. مزيد من سرعة دوران بطيء (متناسبة عكسيا مع أنبوب قطره) ضروري أثناء عملية البذر ، يمكن تسوية مثل هذه EPCs ببطء والتمسك السطح مثل أنبوب تي يتحرك.
لدينا وسيلة لزرع البذور مباشرة قبل غرس ثقافة يتجنب عملي مرات خارج الحي ؛ الخلايا الالتزام الفردي وشكل في وقت لاحق ورقة متكدسة في الجسم الحي ، وتجنب إمكانية الانصمام كورقة مباشرة بعد إعادة إنشاء التدفق. دراساتنا السابقة تبين أنه بمجرد أن EPCs نمت إلى طبقة متموجة ، لأنها تجعل مصفوفة الخلوية الإضافية التي كانوا متمسكين بقوة ، بالإضافة إلى التقليل من أي النزع ممكن من ورقة البطانية. على الرغم من عدم إمكانية انفصال صمي أن يستبعد بالكامل ، فإنه يبدو أن الخطر أقل متعدد الجوانب من التخثر من سطح الجهاز كله ، فإن المشكلة التي تم تصميمها لمنع هذا العلاج.
نهجنا من زرع في القص منخفضة ، والبيئة التخثر من الوريد الأجوف السفلي ويستخدم واحد من النماذج الحيوانية الأكثر ثقة كبيرة للبحث التوافق تخثر الدم والأجهزة 5،6. علما بأن كل الرعاية وأجريت التجارب في الحيوان وفقا للمعهد الوطني للصحة المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وفقط بعد الموافقة على رعاية الحيوان في جامعة ديوك المؤسسية واللجنة الاستخدام.
من أجل الاستفادة من هذه الطريقة بنجاح لاختبار زراعة الحيوية والأجهزة ، من المهم أن أصبح هيكل بصبر الجزء IVC ligate جميع السفن وفرع وريدي استعدادا للالإدراج الجهاز ، بحيث لا حول نزيف الجهاز ينشأ في 'معة كاذبة". آخر خطوة حاسمة في إضافة DPBS في تجويف جهاز من هذا القبيل أن الخلايا على السطح داخل أنبوب تبقى رطبة خلال إغلاق veinotomy وقبل بدء ضخه. إذا لا يمكن أن يكون الجهاز وجدت في الموقع حيث تم زرعها فيه ، قد هاجروا أنه "المنبع' في IVC. ويمكن منع هذا عن طريق وضع خياطة (4 – O Prolene) من خلال جدار الوريد ، ومن خلال 2-3 المقطع ملم من الأنابيب البلاستيكية بحيث يتم راسخ الأنبوب في موقعه الحالي. وينبغي أن يكون الباحث صعوبة في العثور على خلايا fluorescently قبل المسمى هو مبين في الشكل 8 بعد explantation في أنبوب البراءات خلاف ذلك ، فمن المرجح أن الخلايا قد خلع كورقة متماسكة. ويمكن منع ذلك من خلال تشريح لطيف جدا من الوريد ديس المجاورة والتجميع من المقاطع 3 أنبوب تي ، بعد تحديد السياق مع الأنبوب.
لدينا التكنولوجيا يوفر إثبات صحة مفهوم لمنع تخثر الأوعية الدموية عن طريق جهاز EPC – البذر. ويمكن استخدام هذه التكنولوجيا في تطوير زراعة "الاحيائية" اصطف مع المرضى أنفسهم الخلايا البطانية السلف. دراسة الجدوى في نموذجنا حيوان الخنزير تنص على الخطوات الأولى نحو ترجمة هذه "الطب شخصية" في الممارسة السريرية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر لايكا مايكروسيستمز لنصائحهم القيمة على أقسام التصوير والتيتانيوم الجوزاء المنتجات الحيوية لتوفير المصل الخنزير المستخدمة في هذه الدراسة. نود أيضا أن نشكر المعهد الوطني للصحة للحصول على الدعم من خلال المنح "بطانة EPC ذاتي لتحسين الدورة الدموية للتوافق مع الحياة مساعدة الأجهزة" ، RC1HL099863 – 01. كذلك ، ونحن ممتنون للدعم المؤسسة الوطنية للعلوم بحوث الدراسات العليا للزمالة Jantzen الكسندرا. نود أيضا أن نشكر جورج السريع ، ولوي مايك باركر Ianthia للمساعدة في جوانب عديدة من عملية جراحية ومعالجة الحيوانات أبحاثنا. وقد ستيفن أوين لا تقدر بثمن في أجزاء كثيرة من الجهاز الآلي لدينا البذر وقطع أنابيب التيتانيوم.
Materials
| Reagent | Company Name | Catalogue Number | Comments |
| Acepromazine | Boehringer-Ingelheim | BIC670025 | NAC# 10280002 |
| Alconox Powered Precision Cleaner | Alconox | 1104 | |
| Balfour Surgical Retractor | Adler | N/A | |
| Baytril | Bayer | APVMA 46028/0705 | |
| Butterfly Needle (19G) | Terumo | SV19CLK | |
| Chlorhexidine | 3M | 9200 | |
| Clamps (45-degree) | Aesculap | FC339T | |
| DPBS (-/-) | Gibco | 14190-144 | |
| DPBS (+/+) | Gibco | 14040-133 | |
| DuraPrep | 3M | 8635 | |
| EBM-2 Medium | Lonza | CC-3156 | Base for both serum free and full growth medium |
| EGM-2 SingleQuots | Lonza | CC-3162 | Used with EBM-2 for both serum free and full growth medium |
| Electrocautery Tool | Valleylab | SurgII-20 | |
| Emery Cloth | 3M | 60-0700-0425-8 | 240 grit |
| Euthasol Euthanasia Solution | Virback Animal Health | ANADA #: 200-071 | |
| Fentanyl Patch | Actavis | NDC # 67767-120-18 | |
| Flunixin | Schering-Plough | NAC #: 10470183 | |
| Foley Catheter (16F) | Bard | 730116 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heat Gun | Milwaukee | 8988-20 | |
| Heparin | NDC #: 25021 | ||
| Histopaque-1077 | Sigma | H8889-500ML | |
| Intubation Tube | Mallinckrodt | 86113 | |
| Isoflurane | MWI, Meridian | NDC #13985-030 | |
| IV Catheter (18G) | Becton-Dickinson | 381547 | |
| Ketamine | Fort Dodge | NDC #0856-2013 | |
| Level | Swanson | LLA001 | |
| Luer-Lock tip cap | CML Supply | 909-001 | |
| Marcaine | Hospira | NDC #: 0409-1560-10 | |
| Metzenbaum Scissors | Adler | N/A | |
| Micro-introducer (5F) | Galt | KIT 002-01 | |
| Mosquito Forceps | Adler | N/A | |
| Motor | Herbach and Rademan | H1-08 | |
| Oxymorphone | Endo Labs | NDC: 63481-624-10 | |
| PKH26 Dye Kit | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| Porcine Serum | Gemini Bio-Products | 100-115 | 2% concentration in full growth medium |
| Potts Scissors | Adler | N/A | |
| Precise Vista Skin Stapler | 3M | 3998 | |
| PVC Tubing | McMaster-Carr/Insultab | 7132K117 | expanded ID 15.88 mm, recovered ID 7.95 mm |
| Right Angle Medium Size | Adler | N/A | |
| Scalpel Blade (#10-15) | Bard | 373910 | |
| Silicone Tubing | McMaster-Carr | 51735K26 | 16.64 mm OD, 9.52 mm ID |
| Syringe (5 cc) | Becton-Dickinson (BD) | 309603 | |
| Tegaderm | 3M | 90001 | |
| Three-way Stopcock | Kendall | 170060 | |
| Ti Tube | Tico Titanium | N/A | Specified as ½” OD, .065″ wall, .370″ ID, .1737 lbs/ft |
| Trypsin | Lonza | CC-5012 | |
| Trypsin Neutralizing Solution (TNS) | Lonza | CC-5002 | 0.03% |
| Vetropolycin | Pharmaderm Animal Health | NAC #: 12920110 | |
| Vicryl Suture (3-0) | Ethicon | J808T | |
| Water Bath Sonicator | Branson | B200 |
References
- Achneck, H. E. Pathophysiology of bleeding and clotting in the cardiac surgery patient: from vascular endothelium to circulatory assist device surface. Circulation. 122, 2068-2077 (2010).
- Achneck, H. E., Sileshi, B., Lawson, J. H. Review of the biology of bleeding and clotting in the surgical patient. Vascular. 16, 6-13 (2008).
- Arvidsson, S., Askendal, A., Tengvall, P. Blood plasma contact activation on silicon, titanium and aluminium. Biomaterials. 28, 1346-1354 (2007).
- Achneck, H. E. The biocompatibility of titanium cardiovascular devices seeded with autologous blood-derived endothelial progenitor cells: EPC-seeded antithrombotic Ti Implants. Biomaterials. 32, 10-18 (2011).
- Kang, C., Bonneau, M., Brouland, J. P., Bal dit Sollier, C., Drouet, L. In vivo pig models of venous thrombosis mimicking human disease. Thromb Haemost. 89, 256-263 (2003).
- Ueberrueck, T. Comparison of the ovine and porcine animal models for biocompatibility testing of vascular prostheses. J Surg Res. 124, 305-311 (2005).
- Velik-Salchner, C. Normal values for thrombelastography (ROTEM) and selected coagulation parameters in porcine blood. Thromb Res. 117, 597-602 (2006).
- Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Achneck, H. E. . American Heart Association Scientific Sessions, Abstract Oral Sessions, Medical Aspects End Stage Heart Failure: Transplantation and Device Therapies. , (2010).
- Achneck, H. E. Regenerating titanium ventricular assist device surfaces after gold/palladium coating for scanning electron microscopy. Microsc Res Tech. 73, 71-76 (2010).
- Ford, J. W., Welling, T. H., Stanley, J. C., Messina, L. M. PKH26 and 125I-PKH95: characterization and efficacy as labels for in vitro and in vivo endothelial cell localization and tracking. J Surg Res. 62, 23-28 (1996).
