Clonal 확장 CD133 + 간 줄기 세포의 분리

모든 솔루션, 미디어, 악기, 필터 및 튜브는 살균 및 오염의 위험을 줄이기 위해 무균 기법으로 취급해야합니다. 4 사전 및 저장소에있는 모든 버퍼와 미디어 24 시간 준비 ° C. 1. 전체 간장에서 Parenchymal 및 비 – parenchymal 분리 5 MG collagenase, 5 MG의 pronase, 1 MG DNAse를 포함한 10 ML 멸균 PBS에 나사 뚜껑 15 CC 튜브를 사용하여 소화를위한 효소 솔루션을 준비합니다. 기관 승인 (기관 동물 관리 및 사용위원회) CO 2 질식과 같은 방법을 사용하여 마우스를 안락사. 70 % 에탄올 솔루션 euthanized 동물의 복부 영역을 닦아주십시오. 무균 악기를 열고 복강 및 explant 간 EN – 블록을 사용합니다. explanted 간장에서 쓸개를 제거합니다. 폐쇄 무균 접시에 층류 후드에 전체 간장을 전송합니다. 이 절차는 층류 후드에 완료됩니다. 멸균 면도날을 사용하여 살균 접시 1 분에 대해 여러 개의 수평 및 수직 인하의 조합 간 말하다. 장소 ¼ 단계 위의 1.1에서 10 CC collagenase, pronase와 PBS, 그리고 DNAse로 15 CC 튜브에 다진 간 펄프니다. 각 ¼ 다진간에 반복합니다. 37 물 목욕으로 ¼ 다진 간 펄프 및 효소 °​​ C에서 45 분 동안, 뿌리와 1-2 사이클 / 초에서와 장소 튜브. 층류 후드로 전송하기 전에 물을 욕조에서 제거 후 70 % 에탄올로 튜브를 닦으십시오. 이 절차는 층류 후드에 완료됩니다. 멸균 그릇에 수집 70 마이크론 메쉬 필터를 통해 소화 간 펄프를 스트레인. 무균 DMEM 2 ML aliquots 사용 : 10 % 열 inactivated 태아 소 혈청과 F12 미디어 것은 필터를 통해 소화 펄프를 필터를 씻어 매시에 주사기의 플런저의 고무 엔드를 사용합니다. 여과액 약 20 ML 총 볼륨을 5 번 반복합니다. 이 같은 15 ML 튜브에 여과물를 나눕니다. 모든 전송은 층류 후드에 완료하고, ° C 가능하면 4 냉장 원심 분리기를 사용해야합니다. 1 분 50 XG에 원심 분리기. # 1 뜨는 저장하고 parenchymal 펠렛을 삭제. 1 분 50 XG에 뜨는 # 1 원심 분리기. # 2 뜨는 저장하고 펠렛을 삭제. 1 분 50 XG에 뜨는 # 2 원심 분리기. # 3 뜨는 저장하고 펠렛을 삭제. 비 – parenchymal 분수를 얻을 팔분 180 XG에 대한 최종 뜨는에게 # 3 원심 분리기. 2. 레드 세포 용해 층류 흐름 후드의 작동 세포가 차가운 유지하고, 사용하는 솔루션은 4 냉각 ° C. 절차 전날 밤, 10X 집중력 주식 BD 알약은 멸균 증류수로 희석 1시 10분와 버퍼를 Lyse diluting하여 붉은 세포 용해 버퍼를 준비합니다. 1X 4 30 일 ° C.에 대한 저장 solutionshould 절차 전날 밤에, 멸균 PBS, 알부민 0.5 % 소 혈청 및 2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 사용하여 Miltenyi 버퍼를 준비합니다. 0.45 마이크론 필터 진공 필터 유니트를 사용하여 필터 솔루션입니다. 원래 플라스틱 뚜껑이있는 tilter 단위의 상단 커버 및 플라스틱 포장과 보안. 4 Storeentire 필터 유닛 ° 가스를 제거하다 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 12 시간 동안 C. 필터 장치가 12 시간 후에 표준 살균 모자로 대체 수 있습니다. 이 절차는 층류 후드에 완료됩니다. 5 ML 멸균 튜브를 사용하여, 위의 2.1에서 1X 희석 적혈구 용해 완충액 1 ML에 위의 단계를 1.6에서 비 parenchymal 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 층류 후드 밖으로 전송 튜브 캡. 4 15 분 오초과 부화를 위해 부드럽게 와동 ° C 빛으로부터 보호. 오분 200 XG에 원심 분리기. 이 절차는 층류 후드에 완료됩니다. 뜨는에서 lysed RBCs을 취소하고, 다시 중단 펠렛 1 ML 얼음 추위와 살균 Miltenyi 버퍼 인치 오분 200 XG에 원심 분리기. 이 절차는 층류 후드에 완료됩니다. 뜨는 취소하고 다시 중단 펠렛 1 ML 얼음 추위와 살균 Miltenyi 버퍼 인치 PBS의 세포 현탁액의 10 μl를 제거하고 10 μl tryan 파란색을 추가합니다. hemocytometer를 사용하여 remainingnon – parenchymal 세포를 세어보세요. 3. 비 parenchymal 분획에서 CD45 조혈 세포 고갈 층류 흐름 후드의 작동 세포가 차가운 유지하고, 사용하는 솔루션은 4 냉각 ° C. 최대 108 전체 셀 107 셀 당 Miltenyi 버퍼 100 μL의 세포를 일시 중지합니다. 각 107 세포를 20 μL Miltenyi CD45 microbead 항체를 적용하고 4 품어 ° C를 15 분. 오분 200 XG에 추가이 ML Miltenyi 버퍼와 원심 분리기를 추가합니다. 뜨는 제거합니다. 세포 펠렛은 (최대 108 총 세포) 1 ML Miltenyi 버퍼에 다시 일시 중지합니다. 층류 흐름 후드에 필터 전지 Miltenyi LD 자기 칼럼을 사용합니다. 자기 홀더 (Miltenyi MidiMACS 또는 QuadroMACS)에 컬럼을 삽입하여 시작합니다. 여과액 잡으 필터 아래 무균 5 ML 튜브를 놓습니다. 로딩이 ML Milte로 칼럼을 준비nyi 버퍼. 사전 필터 세척이 완료되면, LD 칼럼에 세포를로드합니다. 세포 현탁액이 칼럼 내에서되면, 1 ML Miltenyi 버퍼를 추가하고 1 ML Miltenyi 버퍼가 2 개의 번 씻어 반복합니다. 여과 속도를 증가시킬 열의와 함께 제공되는 플런저를 사용하지 마십시오. 전용 필터가 자기 홀더에 배치 여과물를 수집합니다. 오분 200 XG에서 CD45 – 고갈 비 parenchymal 세포의 약 5 ML의 수집 여과물을 (열이 남아있는 한 ML을 보유) 원심 분리기. 보관 CD45 양성 세포와 컬럼을 삭제. 4. CD133 양성 세포의 유동세포계측법 절연 타원형 세포 미디어를 준비합니다. 거점으로 10 %의 열 inactivated 소태아 혈청과 F12 중간, 그리고 (1 μg / ML) HEPES (5 몰 / L) 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1 % 볼륨 / 볼륨)를 인슐린을 추가 1시 1분 DMEM을 사용합니다. 0.45 마이크론 필터 진공 필터 유니트를 사용하여 필터 솔루션입니다. 10 7 셀 당 100 μL에 Miltenyi 버퍼의 세포를 다시 일시 중지합니다. CD133 – PE 복합 항체의 2 μL를 추가합니다. 제어로 IgG – PE 복합 항체와 함께 품어 세포의 두 번째 그룹을 사용합니다. FACS에 대한 흠없는 제어로 얼룩없이 세포의 세 번째 그룹을 유지합니다. 4 품어 어둠 속에서 15 분 동안 ° C. 2 ML의 얼룩 버퍼에 다시 일시 중지합니다. 오분 200 XG에 원심 분리기. 뜨는 취소하고 다시 중단 펠렛 1 ML Miltenyi 버퍼 인치 이 단계는 특정 기관 수 기준 유동세포계측법 셀 정렬 절차를 사용하여 실시됩니다. 흠없는 세포와 IgG PE 스테인드 세포를 사용, CD133 + 세포 인구의 최적 게이팅에 대한 매개 변수를 정렬 조정합니다. PE는 (R – Phytoerythrin) 일반적으로 488 nm의에서 방출 레이저를 가진 흐름 cytometer와 함께 사용할 수 있습니다. PE에 대한 피크 방출 575 NM이며, FL – 2 채널에 감지됩니다. 참고 : 데이터 수집을위한 셀 퀘스트 프로그램, BD FACS Calibur 또는 BD FACS 유리한 기계를 사용하여, 우리가 250으로 설정되어 측면 산란과 세포 집단을 식별하는 전달 로그 규모 분산형 및 사이드 분산형보기를 사용합니다. FL1과 FL2 로그 규모와 550 세트를 모두하고 있습니다. 이러한 매개 변수 간 비 parenchymal 세포를 볼 초기 시작 장소를 제공하고, 필요한 긍정적이고 부정적인 인구의 강도를 얼룩을 기반으로 조정됩니다. CD133 + 게이트를 사용하여 CD133 + 세포 인구를 격리하고 무균 여과 셀 미디어의 세포를 수집합니다. 5. 세포 배양 방법 원심 분리기의 FACS 5 분 200 XG에서 세포를 수집했습니다. ML 당 약 5,000 세포와 세포 타원형 미디어에서 다시 중지 세포 펠릿. 초기 실험 50,000 세포 / ML에 높은 농도로 시작하고, 기술의 향상 및 전반적인 세​​포 생존과 항복 개선으로 줄일 수 있습니다. BD Biocoat Laminin에 플레이트 전지는 1,000 세포 / cm 2를 사용하여 96 자 번호판을 코팅. 37 humidified 세포 문화 인큐베이터에 넣어 ° C 5 % CO 2. 24 시간 후에, Hepatocyte 성장 인자 (50 NG / NL)와 표피 성장 인자를 (20 NG / ML)을 추가합니다. 단일 세포 들어, 96 잘 Laminin 코팅 플레이트의 각 우물에 타원형 세포 미디어 50 μl에 직접 세포를 분리. 한 긍정적인 세포에만 엄격한 선정 단세포 FACS 설정을 사용합니다. 24 시간 후에, 단계 5.2 위와 같이 HGF와 EGF와 함께 타원형 세포 미디어 50 μl를 추가합니다. 완전히 5~7일 후 미디어를 변경합니다. 확대 식민지는 일반적으로 세포의 총수 도금 및 세포 생존 능력에 따라, 2 주 후에 발생하는 50 % 합류,보다 큰되면, 세포는 다음과 같이 1시 3분 분할 수 있습니다. 트립신 0.05 % – EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 사용하여 분할 세포. 충분히 잘 하단에 충당하기 위해, 50-100 μL / 자 96 자 접시에 적용됩니다. 37 인큐베이터에 넣어 ° 3~5분를위한 C. 각 잘 미디어 100 μL를 추가 5 ML 관에 모든 액체를 전송합니다. 오분 200 XG 각 튜브와 원심 분리기 1 ML 미디어를 추가합니다. 물론 1 개의 새 우물 (1시 3분 비율)로 플레이트에 세포를 사용하여, laminin 코팅 접시 미디어 판의 세포를 다시 일시 중지합니다. 6. RT – PCR을 사용하여 이중 전위 상태를 확인 이 절차는 RNeasy 키트와 함께 제공되는 RNeasy 프로토콜 수첩에 자세히 있습니다. 96 잘 플레이트 식민지에 대한 RNeasy 마이크로 열을 사용합니다. 각 우물에서 문화 미디어 대기음. 직접 각 물론 75 μl 버퍼 RLT을 (RNeasy Kit에서) 추가합니다. 멸균 고무 경찰과 함께 접시 바닥에 다쳤어요. 마이크로 원심 분리기 튜브와 1 분 와동 혼합에 Pipettelysate. lysates 70 %의 에탄올을 추가하고 pipetting하여 섞는다. 10,000 RPM에서 RNeasy 2 ML 수집 관에 배치 열 (으로 RNeasy 키트에 공급), 15 초 마이크로 원심 분리기에서 원심 분리기에 대한 해결책을 전송합니다. eluted 여과액 폐기하십시오. 컬렉션 튜브를 다시 사용합니다. 열을 씻어 10,000 RPM에 15 초간 RNeasy 열 및 원심 분리기 350 μL 버퍼 RW1 (RNeasy 키트)를 추가막. eluted 세차를 폐기하십시오. 70 μL 버퍼 RDD (모두 RNeasy 키트에 제공되는) 10 μL DNase I 주식 솔루션입니다. 상온에서 15 분 RNeasy 열 막과 부화 80 μL DNase I 버퍼 RDD 보육 믹스를 추가를 추가합니다. 멤브레인을 씻어 10,000 RPM에 15 초간 RNeasy 열 및 원심 분리기 350 μL 버퍼 RW1 (RNeasy 키트)를 추가합니다. eluted 세척 및 수집 튜브를 폐기하십시오. 새로운 두 ML 수집 튜브 (RNeasy 키트에 제공된)에서 RNeasy 열을 삽입합니다. 멤브레인을 씻어 10,000 RPM에 15 초간 RNeasy 열 및 원심 분리기 500 μL 버퍼 RPE을 (RNeasy 키트) 추가합니다. eluted 세차를 폐기하십시오. RNase없는 물 (RNeasy 키트)를 사용하여 80 % 에탄올을 준비합니다. 10,000 RPM에서 2 분 동안 RNeasy columnand의 원심 분리기에 80 % 에탄올 500 μL를 추가합니다. eluted 세차를 폐기하십시오. 5 분 최대 속도 RNeasy 새로운 두 ML 수집 관에서 열 (RNeasy 키트)와 원심 분리기를 놓습니다. 모든 eluted 세척 및 수집 튜브를 폐기하십시오. 새로운 1.5 ML 수집 튜브 RNeasy 열 (RNeasy 키트)를 넣으십시오. 전체 속도로 1 분 열 막과 원심 분리기의 중심 14 μL RNase없는 물 (RNeasy 키트)를 추가합니다. 정화 RNA와 여과수를 수집하고 마이너스 즉시 또는 상점 cDNA 만드는 경우에는 얼음으로 전송 80 ° C 나중에 사용하기 위해. 최종 10 단위의 농도 / 얼음처럼 차가운 1X 버퍼 RT에서 μL에 Omniscript.Dilute RNase 억제제를 사용하여 역방향 전사. 15 초, 5 초 동안 펄스 원심을위한 와동. Omniscript 프로토콜의 13 페이지에 따라 얼음에 신선한 마스터 믹스를 준비합니다. 15 초, 5 초 동안 펄스 원심을위한 와동. 모든 반응에 필요한 총 소요되는 10 % 이상 mastermix의 볼륨을 준비하는 것이 좋습니다. 마스터 믹스를 포함하는 각각의 튜브에 템플릿 RNA를 추가합니다. 15 초, 5 초 동안 펄스 원심을위한 와동. 37 60 분 품어 ° C. HotStarTaq DNA의 중합 효소를 사용하여 hepatocyte (알부민)와 cholangiocyte 특정 유전자의 PCR 증폭. HotStarTaq 프로토콜 책의 15 페이지 당 반응 믹스를 준비합니다. 20시 / μl의 농도 재고 primers를 diluting 추천, 1 μL / 반응 관과 순방향 및 역방향 primers 사용됩니다. 처음 RNA 추출에 사용되는 세포의 숫자에 따라, 우리는 시작 3 반응 튜브 (로드 제어를위한 β – 굴지, 알부민, 그리고 KRT19) 중에서 최종 cDNA를 분리하는 것이 좋습니다. PCR 뇌관 디자인은 표 1에 나열됩니다. thermocycler에 반응 튜브를 놓습니다. 초기 실험에 대한 다음과 같은 프로그램을 추천 : 95 ° Cfor 십오분 95 다음 X 1주기 ° 30 초 동안 C, 55 ° 30 초 동안 C, 72 ° 30 초 동안 C 10 분 동안 72 ° C에 이어 X 35 사이클. PCR 제품은 아가로 오스 겔을 임신 ethidium 브로마이드를 사용하여 분석하고 있습니다. 7. CD133 + 줄기 세포의 종양 가능성 확인 이 절차는 4 단계 또는 5 단계에서 교양되었습니다 세포를 사용 갓 격리 세포로 할 수 있습니다. 우리는 교양 세포와 초기 실험을 수행하는 것이 좋습니다 등 갓 고립된 세포가 생존하고 감소 수율 감소됩니다. 위의 단계를 5.5에서 0.05 % 트립신 – EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 사용하여 세포를 Trypsinize. 37 3~5분 부화 ° C 후, 각 물론 미디어의 100 μL를 추가하고 각각 5 ML 튜브 (1 자 = 1 관) 각 우물에서 모든 액체를 전송합니다. 오분 200 XG 각 튜브와 원심 분리기 1 ML 미디어를 추가합니다. 1 ML 얼음 차가운 PBS로 세포를 다시 일시 중지합니다. PBS의 세포 현탁액의 10 μl를 제거하고 10 μl trypan 파랑를 추가합니다. trypan 파랑 제외를 사용하여 라이브 세포의 숫자를 결정합니다. FACS에게 분리된 세포를 사용하는 경우, 휴대폰 번호는 FACS 절연 개수에 따라 결정됩니다. 5 분 다시 정지 1 X 10 6 살 cells/100 μl의 농도로 PBS 인치 200 XG에 원심 분리기 세포 100 μl Matrigel을 추가합니다. 6 주 된 면역 – 결함 누드 생쥐 subcutaneously 28 gague 바늘을 사용하여 주입했다. 사이트 당 200 μl 1 X 10 6 세포를 주사. 생쥐는 매일 종양 성장에 대한 모니터링입니다. 일단 종양은 일반적으로 3~4주 보육 후, 형태, 종양 볼륨 캘리퍼스 (높이 X 길이 X 폭)를 사용하여 측정됩니다. 8. 대표 결과 : 정상적이고 건강한 murine 간장에서 CD133 + 간 줄기 세포의 예상 수확량은 세포 간 1,000 ~ 5,000이다. 이러한 세포는 정지 간장에 상대적으로 드문 문화에 잘 확장되지 않습니다. 우리는 정상적인 간장에 단일 세포 분석을 사용하지 않는 것이 좋습니다 확대 것입 가능한 세포의 수율이 매우 낮습니다. / – – 또는 간장 특정 Pten – / – 생쥐, 2-4 cel의 예상 번호 등 6주 1 등 MAT1a 같은 만성 부상의 결과로 유전자 조작에 대한 DDC 0.1 %의 다이어트로 큰 만성 부상 간은에 대한최대 100,000 셀에 절연 / 간장 (그림 2)와 있나요 격리 증가. , 자연 종양 속도의 지식을 유전자 모델을 사용하는 것이 중요이면, 간 줄기 세포 분리에 대해 이러한 절차가 종양이 무료로 동물에서 실시하여야한다. 예를 들어, MAT1a가있다면 – / – 모델이 18 개월에 자발적인 종양을 형성하고, 우리는 이전에 어떤보고 자발적인 종양으로, 더 나중에 15~16개월 이상의 동물을 사용하지 권장합니다. 만성 부상 모델에서 단일 세포의 분리는 프로 시저가 마스터되면 하나의 세포에서 확장하고 세포 생존이 보장됩니다 몇 가지 (3-9 colonies/96 잘 플레이트) 식민지를 얻을 것입니다. 칠일 후에 확장된 하나의 CD133 + 세포에서 파생된 식민지 3 현재 대표적인 위상 콘트라스트 이미지를 그림. BI – 잠재력의 상태 확인은 알부민과 RT – PCR Krt19를 사용하여 실시됩니다. 확장된 하나의 세포에서 식민지는 hepatocytes의 마커 (알부민)와 cholangiocytes (Krt19)에 대한 표현을 모두 보여줄 것입니다. 그림 4는 칠일에 약 25 세포 / 식민지와 세 격리 식민지에서 이중 잠재적인 표현을 보여줍니다. CD133 + 정상 간 및 화학적으로 유도된 간 상해 (6 주 예 : DDC 0.1 %의 다이어트)에서 줄기 세포가 누드 마우스에 종양을 형성하지 않습니다. CD133 + 특정 유전 모델 (MAT1a – / – 또는 간장 특정 Pten – / – 생쥐)에서 줄기 세포가 늦은 사전 종양 만성 부상 단계에서 후반 격리된 경우 누드 마우스에 종양을 형성합니다. 이 종양 형성 표현형 현재 암 줄기 세포로 식별됩니다 2-4 예를 들어, MAT1a -. / – 생쥐는 만 18 주가되면 자연 간 종양을 형성. 간 질환의 늦은 만성 부상 단계 동안 15-16주에서 격리 CD133 + 간 줄기 세포가 누드 마우스에 종양을 형성합니다. 그림 5는 단일 CD133 + 간 줄기 세포의 체외에서 확장 1 X 10 6 세포의 상호 주입에서 대표 종양을 보여줍니다. 유전자 앞으로 프라이머 역방향 프라이머 β – 굴지 5' – TGTTACCAACTGGGACGACA – 3 ' 5' – GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA – 3 ' 알부민 5' – CATGCCAAATTAGTGCAGGA – 3 ' 5' – GCTGGGGTTGTCATCTTTGT – 3 ' 각질 19 5' – TGCTGGATGAGCTGACTCTG – 3 ' 5' – AATCCACCTCCACACTGACC – 3 ' 표 1 : RT – PCR을 위해 뇌관 디자인 그림 1 : 방법의 전체 개략도. 그림 2 : CD133 + 간 줄기 세포가 매우 풍부한 CD45 고갈 비 parenchymal 분획에서 확인된 야생 형 생쥐의 제어 손상되지 않은 간이 매우 풍부한 CD45 고갈 비 parenchymal 분수 이내 0.4 % CD133 + 세포를 보여줍니다.. 유전자에 MAT1a 아웃 똑 – / -, 만성 간 손상의 모델입니다, CD133 인구는 같은 매우 풍부한 소수의 10 배 이상 확대. 그림 3 : 단일 CD133 + 클론의 식민지 확대 laminin 코팅 96 잘 접시에 확장 한 CD133 + 세포에서 파생된 네 식민지의 위상 대비 영상.. 그림 4 :. CD133 + 간 줄기 세포 clonally 확대 식민지에서 이중 잠재적인 유전자 발현은 일 7시, 식민지는 약 25 세포 수 있습니다. 유전자 발현은 CD133 + 세포의 이중 잠재적인 상태를 확인, hepatocyte 마커 알부민과 cholangiocyte 마커 Krt19 표현을 보여줍니다. 그림 5 : CD133 + 간 줄기 세포가 누드 마우스에 종양을 형성 화살표 MAT1a에서 주입 1×10 6 CD133 + 세포 후 사주 성장 종양 표시 – / – 모델.. CD133 + 같은 CCL 4 또는 0.1 % DDC의 식단으로 독소 유발 만성 간 손상의 세포는 종양을 형성하지 않습니다. 종양 형성은 줄기 세포의 인구 내에서 악성 가능성, 또는 암 줄기 세포 표현형을 식별하는 데 사용됩니다.